[发明专利]一种检测microRNA-21的生物传感器及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于纳米金颗粒团聚产生表面增强拉曼散射检测microRNA‑21的生物传感器及其制备方法与应用。利用目标物microRNA‑21能够特异性结合开关保护核酸链，将纳米金颗粒表面的Walker Chain释放，从而利用核酸酶将纳米金表面更短的Track Chain催化水解，致使纳米金颗粒失去了核酸链保护，在高盐缓冲液中团聚，产生表面等离子体共振效应，极大的增强金纳米颗粒表面电磁场强度，使标记在纳米金颗粒表面的拉曼染料产生表面增强拉曼散射（SERS）效应，在特定的位置出现拉曼光谱；当反应液中不存在microRNA‑21时，无法将开关保护核酸链置换下来，从而无法进行后续的纳米金团聚的反应，进而没拉曼散射光谱产生；实现了快速、灵敏、安全的microRNA‑21活性检测。

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域，特别涉及基于纳米金颗粒团聚产生表面增强拉曼散射检测microRNA-21的生物传感器及其制备方法与应用。

背景技术

microRNAs（miRNAs）是一类单链、内源性表达、非蛋白编码的小RNAs，长度一般在19~23个碱基，在生物体内起到基因表达的转录后修饰的作用。miRNAs在细胞内产生需要经过一个复杂的生理过程。首先，经过RNA聚合酶II在基因内部或者基因之间催化处理，形成长度为1~3 kb的初级miRNAs，然后，再经过RNase III Drosha的催化处理和一个双链RNA结合蛋白Pasha的复合作用，形成一个70~100 bp的发夹结构核苷酸链，并且在茎部末端含有miRNAs前体；其次，由Exportin-5运输至细胞核外，进入细胞质；最后，miRNAs前体进一步被RNase III Dicer催化水解成18~24 bp的核酸单链，最终形成miRNAs。此外，miRNAs的主要功能是形成RNA诱导基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），此复合物会全部或者部分的与其目标miRNA进行匹配，从而诱导miRNA进行碱基互补配对杂交，抑制了miRNA的翻译；因此，通过控制miRNA的水平，最终实现了在蛋白质水平上的表达调控。因此，miRNA的表达水平对于肿瘤的抑制或者作为某些疾病的生物标志物具有重要的参考意义。

近年来，随着检测技术的不断进步，越来越多的检测策略应用到miRNAs的检测中，这对于进一步详细了解miRNAs的作用机理以及在分子水平上利用miRNAs进行诊断和药物筛选具有极大的帮助。首先，miRNAs是一类小核酸分子且在人体内含量极低，因此，要实现对其高灵敏的检测，需要进行扩增放大，然后再进行浓度检测分析。传统的聚合酶链式反应（PCR）所需要的引物跟miRNAs长度类似，所以，较低的融链温度极大的降低了PCR的扩增效率；其次，目前发现的miRNAs仅占总RNA的约0.01%，并且每一族的miRNAs序列相似度高，因此，这就需要高灵敏、高特异性的检测方法来实现对miRNAs的检测。

核酸适配体传感器因其高稳定性、高灵敏度和容易定量的特点吸引了人们广泛的兴趣，大量的基于荧光和比色的miRNAs适配体核酸探针检测方法不断涌现。但是，荧光方法存在抗光漂白的缺陷、比色法存在灵敏性差的问题。

发明内容

针对以上传统方式检测miRNAs活性存在的等问题，本发明提供了一种采用核酸链和纳米金颗粒为底物，基于表面增强拉曼散射（SERS）技术实现对miRNAs活性灵敏、精准的检测，克服了荧光法的光漂白的问题、比色法灵敏度差的问题。

本发明是通过以下步骤得到的：

一种检测microRNA-21活性的生物传感器，包括DNA Walker、Track DNA、ProtectProbe、金纳米颗粒、缓冲液、外切酶III、目标物miRNAs；

所述的DNA Walker的序列如SEQ No.1所示：5’---SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTCACCGACGTATGACTGAT ---3’；

所述的Track DNA的序列如SEQ No.2所示：5’ ---SH—ACGTCGGTG ---3’；