[发明专利]基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法

说明书

本发明公开了一种基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法，包括：卵巢上皮细胞CHO进行体外培养；应用转染试剂lipofectamine 3000将LC3‑EGFP转染到卵巢上皮细胞CHO中；利用分选流式细胞仪将转染成功的CHO细胞分选出来，得到过度表达自噬的卵巢上皮CHO细胞株。还公开了利用该构建方法构建的细胞损伤模型，以及利用该细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，包括：检测过度表达自噬对CHO细胞的线粒体功能、线粒体氧化应激水平、细胞周期阻滞的影响。本发明所构建的细胞损伤模型是一种可靠的、可重复性俱佳的标准化卵巢上皮细胞体外损伤模型，提供了一个新的过度自噬引起的细胞损伤研究平台。

技术领域

本发明涉及细胞实验技术领域，特别是涉及一种基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法。

背景技术

自噬是指细胞将一些受到损伤的细胞器、细胞内折叠或聚集错误的蛋白等细胞质成分进行包裹运送至溶酶体并进行降解的过程。自噬与细胞的生存、死亡以及永生化息息相关，自噬可以清除细胞代谢过程中产生的废物而有利于细胞生存。自噬是细胞应对各种病理变化及损伤的一种适应性保护机制，而且也对细胞的分化、发育和维持细胞的稳态起重要的作用。

自噬是依赖自身溶酶体来程序性地消化自身且形成特征性自噬小体，又被称为“Ⅱ型程序性死亡”。自噬对细胞的影响并不一定是导致细胞走向死亡，然而细胞自噬水平过高可以溶解自身重要的结构而导致细胞死亡。

在卵巢组织的一些激活自噬的通路中，当自噬活动激活过于频繁时，会引起卵巢组织的加速衰老，进一步可能导致卵巢组织细胞的程序性死亡，进而引起早发性卵巢功能不全(POI)。在某种情况下，自噬过度可能会出现一些病理状态，如颗粒细胞死亡。越来越多的研究发现，卵巢颗粒细胞过度自噬导致的卵泡闭锁和停止发育，可能是早发性卵巢功能不全(POI)的发病机制之一。建立一种基于过度自噬的细胞损伤模型，进一步研究自噬在POI发病过程中的机制，可以为临床治疗POI提供更好的理论依据和治疗策略。

发明内容

基于细胞损伤模型的建立研究现状，当前关于细胞损伤相关疾病的研究主要存在以下技术问题：(1)细胞损伤模型成功率低；(2)细胞损伤后的评价指标不客观；(3)细胞损伤后的评价体系不系统；(4)可重复性较差。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：卵巢上皮细胞CHO进行体外培养；

步骤2：应用转染试剂lipofectamine 3000将LC3-EGFP转染到卵巢上皮细胞CHO中；

步骤3：利用分选流式细胞仪将转染成功的CHO细胞分选出来，得到过度表达自噬的卵巢上皮CHO细胞株；

步骤4：根据过度表达自噬的卵巢上皮CHO细胞的线粒体功能和线粒体氧化应激水平的改变，以及细胞周期阻滞情况，对过度表达自噬引起细胞功能的损伤情况进行鉴定，得到所述基于过度自噬的细胞损伤模型。

在本发明一个较佳实施例中，在步骤1中，卵巢上皮细胞CHO进行体外培养的方法为：将CHO细胞在含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/ml青霉素、0.1mg/L链霉素的DMEM培养基，并在含5％CO₂环境下，37℃培养箱中生长。

进一步的，所述构建方法还包括利用激光共聚焦显微镜观察对步骤3所得的过度表达自噬的卵巢上皮细胞CHO细胞株进行验证。

为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种利用如上所述基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法构建的细胞损伤模型。

为解决上述技术问题，本发明还采用的另一个技术方案是：提供一种利用如上所述的细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，包括：

(1)检测过度表达自噬对CHO细胞的线粒体功能的影响；