[发明专利]基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法

权利要求书

1.一种利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，包括：

（1）检测过度表达自噬对CHO细胞的线粒体功能的影响；

（2）检测过度表达自噬对CHO细胞的线粒体氧化应激水平的影响；

（3）检测过度表达自噬对CHO细胞的细胞周期阻滞的影响；

其中，基于过度自噬的细胞损伤模型的构建方法，包括以下步骤：

步骤1：卵巢上皮细胞CHO进行体外培养；

步骤2：应用转染试剂lipofectamine 3000将LC3-EGFP转染到卵巢上皮细胞CHO中；

步骤3：利用分选流式细胞仪将转染成功的CHO细胞分选出来，得到过度表达自噬的卵巢上皮CHO细胞株；

步骤4：根据过度表达自噬的卵巢上皮CHO细胞的线粒体功能和线粒体氧化应激水平的改变，以及细胞周期阻滞情况，对过度表达自噬引起细胞功能的损伤情况进行鉴定，得到所述基于过度自噬的细胞损伤模型；

其中，检测过度表达自噬对CHO细胞的线粒体氧化应激水平的影响的方法包括利用MitoSOX 染色或从CHO细胞中提取抗氧化酶SOD2蛋白，利用Western Blot检测过度表达自噬对CHO细胞的抗氧化酶SOD2表达的影响；

检测过度表达自噬对CHO细胞的细胞周期阻滞的影响的方法包括从CHO细胞中提取CDC2和CDK6细胞周期相关蛋白，利用Western Blot检测过度表达自噬对CHO细胞的细胞周期相关蛋白CDC2和CDK6表达的影响。

2.根据权利要求1所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，所述线粒体功能的影响包括表达水平、线粒体膜电位、线粒体融合相关蛋白表达的影响。

3.根据权利要求2所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，检测过度表达自噬对CHO细胞的线粒体表达水平的影响的方法是利用MitroTracker red染色。

4.根据权利要求2所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，检测过度表达自噬对CHO细胞的线粒体膜电位的影响的方法是利用TMRE染色。

5.根据权利要求1所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，在步骤1中，卵巢上皮细胞CHO进行体外培养的方法为：将CHO 细胞在含有10%胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/ml 青霉素、0.1 mg/L 链霉素的DMEM培养基，并在含5% CO₂环境下，37°C培养箱中生长。

6.根据权利要求1或5所述的利用细胞损伤模型检测过度表达自噬对细胞功能损伤的方法，其特征在于，所述构建方法还包括利用激光共聚焦显微镜观察对步骤3所得的过度表达自噬的卵巢上皮细胞CHO细胞株进行验证。