[发明专利]一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法

说明书

本发明公开了一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化以及基于HPLC的拆链方法，可以实现人胰岛素及其类似物A、B链N末端氨基酸序列的正确测定，该法经济、环保、节省时间。

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化以及基于HPLC的双链拆分方法

背景技术

蛋白质和多肽的氨基酸排列顺序即氨基酸序列是其结构和功能的基础，因此在开发蛋白质和多肽类药物时，必须要保证氨基酸序列是正确的，这就需要进行蛋白质和多肽的测序。基于Edman降解原理和氨基酸序列分析仪的N末端氨基酸序列分析是最经典的蛋白质和多肽的测序方法。

用于治疗糖尿病的人胰岛素是一种广泛使用的生物技术药物，人们基于不同的应用目的对人胰岛素进行了改构，研发出了系列人胰岛素类似物，包括门冬胰岛素、羟脯胰岛素、赖脯胰岛素、甘精胰岛素、地特胰岛素、赖精胰岛素等。人胰岛素及其类似物结构基本相似，都由A、B两个肽链组成，含有2个链间二硫键和1个链内二硫键。

不同于一般的蛋白质类生物技术药物，人胰岛素及其类似物的N末端氨基酸序列分析有两个问题需要解决，一是不能确定每一循环测出的氨基酸到底是属于A链还是B链，因此必须将A、B链拆开，分别测定。二是半胱氨酸必须经烷基化修饰，转变成PE-PTH-Cys才能被检测到。

针对这两个问题，我们开发了基于HPLC的人胰岛素及其类似物拆链技术，同时将二硫键的还原和半胱氨酸的烷基化修饰融于HPLC的进样程序中，在线完成。

所涉及的方法和步骤具体如下：

发明内容

本发明针对人胰岛素及其类似物N末端的序列分析，采用基于HPLC的双链拆分技术和在线的二硫键的还原和半胱氨酸的烷基化修饰。达到分别正确测定人胰岛素及其类似物A、B 链N末端氨基酸序列的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：

1、二硫键还原和烷基化修饰

1)称取适量样品，以缓冲液(0.1M Tris-cl pH8.4，含6M盐酸胍)直接溶解成浓度为 5mg/ml的溶液，

2)新鲜配制反应液：30μLDTT溶液(30mg/mL)，再加入1.5μL 4-乙烯基吡啶，混匀。

3)HPLC进样程序：

吸取50μL样品溶液，吸取5μL反应液，混匀，静止10分钟后，注入HPLC。

2、A、B肽链的拆分

1)色谱柱为C18液相色谱柱(4.6×150mm，5μm)。流动相为水-乙腈(各含0.1％TFA)。

2)梯度洗脱：