[发明专利]一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法

权利要求书

1.一种用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于包括以下步骤：

1、二硫键还原和烷基化修饰

1)称取适量样品，以缓冲液(0.1M Tris-cl pH8.4，含6M盐酸胍)直接溶解成浓度为5mg/ml的溶液，

2)新鲜配制反应液：30μL DTT溶液(30mg/mL)，再加入1.5μL 4-乙烯基吡啶，混匀。

3)HPLC进样程序：

吸取50μL样品溶液，吸取5μL反应液，混匀，静止10分钟后，注入HPLC。

2、A、B肽链的拆分

1)色谱柱为C18液相色谱柱(4.6×150mm，5μm)。流动相为水-乙腈(各含0.1％TFA)。

2)梯度洗脱，

时间	流动相B
0min	10％
2min	10％
35min	60％

流速设置为1mL/min。检测波长为214nm。分别收集保留时间为16分钟(A链)和20分钟(B链)的色谱峰，待分析。

3、N末端氨基酸序列分析

分别取20μL收集的样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上；氩气吹干，上样，蛋白质序列分析仪自动进行样品的N末端氨基酸序列分析。

2.根据权利要求1所述的用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于：

二硫键还原和烷基化修饰方法在线完成，减少了人工操作，避免人体和有机毒害试剂过多接触，既节省了时间，又保护身体健康。

3.根据权利要求1所述的用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于：

将胰岛素双链拆分开，分别上样分析，实现了准确测定。

4.根据权利要求1所述的用于人胰岛素及其类似物N末端序列分析的在线烷基化及HPLC拆链方法，其特征在于：

经过HPLC的分离制备的样品，无需脱盐处理。