[发明专利]一种用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法

说明书

本发明公开了一种用于生物技术药物N末端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法，样品直接在PVDF膜上一步完成烷基化修饰，省去换液、脱盐、冻干等步骤，所用试剂更为经济，环保，大大节省前处理时间。

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种用于生物技术药物N术端半胱氨酸序列分析的快速烷基化方法。

背景技术

生物技术药物的N末端氨基酸序列分析是中国药典明确规定的内容，要求测定N端15个氨基酸。采用氨基酸序列分析仪测定蛋白质药物的N术端氨基酸基于Edman降解原理，从蛋白质的自由N端起，经过衍生、切割、转化等化学反应步骤，生成PTH-氨基酸。PTH-氨基酸在紫外光269nm处有最大吸收，经高效液相分离分析和保留时间最终确认氨基酸的排列顺序。

在2015版中国药典三部收录的治疗类生物制品中2种促红素相关产品、3种干扰素α1b相关产品、4种干扰素α2a相关产品、11种干扰素α2b相关产品、4种表皮生长因子相关产品的N末端15个氨基酸序列分析包含了半胱氨酸的测定，另外还有大量药典未收录的生物技术药物N末端需测定半胱氨酸，如胰岛素以及类胰岛素相关产品。

半胱氨酸在蛋白质中一般以二硫键形式存在，必须要将二硫键打开，并且进行烷基化修饰才有可能在氨基酸序列分析色谱图上检测到半胱氨酸。在蛋白质序列分析仪生产厂家美国ABI公司提供的User Bulletin上，描述了半胱氨酸的烷基化步骤，包括：

1)将干粉状样品(需脱盐处理)溶解于50μL反应液(包含6M盐酸胍、0.25M Tris-HCl、2mM EDTA、调pH值为7.5)；

2)加入2μL新鲜制备的10％β-巯基乙醇；

3)充氩气保护，混匀，在室温避光放置10分钟；

4)加入2μL4-乙烯基吡啶-乙醇溶液(1∶6，新鲜制备)；

5)充氩气保护，混匀，在室温避光放置10分钟；

6)用RP-HPLC小柱进行脱盐处理；

7)吸取10μL样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上，风干或氩气吹干，洗涤数次，待完全干燥后上样分析

一般来说，蛋白质样品都是保存在含盐的缓冲液中，因此利用上述样品处理方法包含了两次脱盐处理和冻干步骤；需使用较昂贵的脱盐小柱；一次二硫键还原步骤，需使用到了具强烈恶臭味道和较强毒性的β-巯基乙醇，再加上烷基化步骤和避光放置时间，整个样品前处理过程耗时在数小时以上。

我们针对上述弱点对方法进行了改进，具体如下：

发明内容

本发明针对生物技术药物N末端半胱氨酸序列测定，采用改进的半胱氨酸烷基化方法，在满足半胱氨酸正确测定的同时达到快速，低成本和环保的目的。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：

1)吸取10μL样品点在甲醇浸润过的PVDF膜上，风干或氩气吹干，洗涤数次；

2)反应缓冲液配制：0.1M Tris-HCl缓冲液(pH8.4)含6M盐酸胍、0.02M DTT、0.2％4-乙烯基吡啶；

3)将PVDF膜放入100μL上述反应液中，室温避光放置10分钟；

4)取出PVDF膜，去离子水洗涤数次，风干后上样。

本发明的优点及有益效果为：

1)本发明采用的烷基化方法直接在PVDF膜上完成反应，避免了换液，脱盐，冻干等步骤，更节省时间。

2)本发明不使用脱盐RP-HPLC小柱，更为经济环保。