[发明专利]一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法

说明书

一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法。包括：a选择受CCR抑制的目的基因，如ackA、ycgE、ptsH、budA、acsA、xylA与sucC等，确定其cre box的位点及碱基序列；b设计一组与cre box共有序列目标片段相似性为30～100％的gRNA，确保能实现多个目标cre box片段的编辑；c构建含有CRISPR/Cas9基因座和gRNA的整合型质粒，并转入芽孢杆菌，实现对基因组多个cre box位点的编辑。采用本发明提出的基因改造方法，能同时解除多个基因的CCR阻遏效应，从而增加细菌的次级代谢产物，能够得到一种高分泌型基因工程受体菌。CCR效应的解除，提高了该工程菌的葡萄糖耐受性，使其具有较强的细胞分泌能力，能够作为微生物发酵的受体细胞。

技术领域

本发明涉及分子生物学与基因工程领域，特别是一种耐糖高分泌型基因工程受体菌基因改造和构建方法。

背景技术

现在工业中使用的常见工程受体菌一般为大肠杆菌与枯草芽孢杆菌等，利用基因重组技术将特定目的蛋白基因导入受体菌中，从而得到需要的蛋白，再经分离纯化处理得到用于治疗的蛋白药物等。其中大肠杆菌具有遗传背景清楚、受体系统完备、生长迅速和培养简单等优点，但大肠杆菌的产物繁杂，不易分离而且具有多种内毒素，在工业应用方面受限。枯草芽孢杆菌同样具有生长快、培养简单、遗传背景清楚同时不含内毒素的优点，但遗传不稳定且受体系统不完备。

微生物对碳源的利用有一定的先后次序，它们总是优先利用易于分解的碳源，例如葡萄糖。而首先被利用的碳源的分解物，会抑制其它碳源的利用，这种抑制会影响糖代谢相关的基因或操纵子的调控和表达水平，这种现象被称为碳分解代谢物阻遏(CarbonCatabolite Repression CCR)。许多糖代谢相关基因中都存在一段相似的回文序列，在基因转录起始点附近，是一种顺式作用元件，这段回文序列的突变会导致对应基因单一糖原抑制作用的消失，但不影响基因表达，这一序列被称为crebox。在工业应用中许多菌种都存在这种效应，抑制了菌种对碳源的利用。在工业生产中CCR效应会降低细胞比生长速率，导致产能降低。本发明中采用的短小芽孢杆菌在自然界中存在广泛，能产生并分泌多种蛋白酶，有改造成优势基因工程菌的潜力。

发明内容

本发明目的是解决现在使用的工程受体菌含有内毒素或遗传不稳定，以及各类工程受体菌在工业应用中受CCR效应限制等问题，并提高工业产率，提供一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法。本发明使用新型CRISPR/Cas9基因编辑技术，采用一种非专一性gRNA引导Cas9蛋白同时编辑多个基因的crebox顺式元件，解除CCR效应构建耐糖高分泌型基因工程受体菌。通过这种方法可获得用于构建各类高产基因工程受体菌株。

本发明的技术方案：

一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术一次性同时编辑多位点crebox序列，导致转换与颠换等多种突变，解除短小芽孢杆菌的CCR效应，得到耐糖高分泌型工程菌，包括以下步骤：

1)确定糖代谢相关基因中待编辑的目的基因，所述目标基因均为糖代谢途径中具有CCR效应且含有crebox这一顺式元件的基因，如ackA、ycgE、ptsH、budA、acsA、xylA与sucC等等，确定目的基因中cre box的序列及位置，cre box约为14～15bp，通式为：WWGNAANCGNWNNCW。

2)根据多个目的基因crebox的序列以及其附近20bp碱基，设计多组目标片段，对多个目的基因的多组目标片段分析比对后，设计出与单个基因目标片段序列相似性为30～100％的几种非特异性gRNA序列。所设计的目标片段序列包含部分或全部的crebox序列，约为4～15bp。

3)将设计合成的gRNA与pCas9质粒连接构成重组质粒，分别采用两种方法进行质粒重组：一种是将所设计的多个gRNA序列重组到同一个pCas9质粒中；另一种是将多个gRNA序列分别与pCas9质粒连接构成多种重组质粒。