[发明专利]一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法

权利要求书

1.一种耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，利用CRISPR/Cas9技术一次性同时编辑多位点crebox序列，导致转换与颠换的多种突变，解除短小芽孢杆菌的CCR效应，得到耐糖高分泌型工程菌，步骤如下：

1)在糖代谢相关基因中挑选目的基因，并确定目的基因的crebox序列及位置；

2)根据目的基因的cre box序列以及其附近20bp碱基设计多组目标片段，对多个目的基因的多组目标片段对比分析确定gRNA序列；

3)将已经确定的gRNA序列与pCas9质粒重组构成重组质粒；

4)将重组质粒转入大肠杆菌中进行扩增和纯化，再转入短小芽孢杆菌中对目的基因进行编辑，构建重组菌株Bacilluspumilus LG3145。

2.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：所设计的gRNA序列与多个基因的目标片段序列具有30％～100％的相似性，能够控制Cas9蛋白在基因组中的脱靶范围，实现一个gRNA对多个目标基因的编辑功能。

3.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：用于一次性同时编辑多位点cre box序列的gRNA，其所对应的目标片段含cre box序列的4～15bp。

4.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：所述目标基因均为糖代谢途径中具有CCR效应且含有cre box这一顺式元件的基因。

5.根据权利要求1所述耐糖高分泌型基因工程受体菌的构建方法，其特征在于：所述重组质粒的构建采用如下两种方法：一种是将设计的能够一次性同时编辑多位点cre box序列的多条gRNA分别与多个pCas9质粒重组为多种重组质粒；另一种是将能够一次性同时编辑多位点crebox序列的多条gRNA同时与同一个pCas9质粒重组构成重组质粒。