[发明专利]宫颈癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用

说明书

本发明提供宫颈癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用，通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测宫颈癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选宫颈癌高甲基化候选基因，针对宫颈癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现宫颈癌的早期筛查与诊断。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种宫颈癌基因甲基化检测引物探针组合及其试剂盒与应用。

背景技术

宫颈癌(cervical cancer)是女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤中居第二位，其发病率和死亡率仅次于乳腺癌，严重威胁女性身心健康。宫颈癌的发生几乎都是与高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染相关，发病年龄以40至50岁为最多，近年来发病有年轻化趋势。宫颈癌发生在子宫颈部位，多数为鳞癌，其次为腺癌、腺鳞癌，少见类型有小细胞癌、透明细胞癌等。宫颈癌的发生和发展是一个缓慢、渐进的过程，通常是由宫颈上皮内瘤变(CINI→II→III)→原位癌→早期浸润癌→浸润癌的连续发展过程，CINI发展成为浸润癌约需10～15年，原位癌发展为浸润癌约3～4年，需要主动筛查才会被发现。宫颈癌治疗效果与临床分期密切相关，早期癌宫颈癌通常有较好的预后，尽早发现宫颈癌可增加手术保留子宫的机会，提高总体生存率，早诊早治是提高治愈率的关键，同时宫颈癌有复发的可能性，因此预后监控亦要引起重视，如何尽早发现宫颈癌以及术后如何及时检测到宫颈癌的复发具有非常重要的临床意义。

目前宫颈癌的诊断技术有：1)宫颈刮片细胞学检查：易受到主观因素影响，有一定的假阴性率，容易漏诊；2)影像学技术：MRI检查、B超检查、CT检查，但对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；3)阴道镜检查：肉眼并不能观察出是否癌变，对有阴道狭窄、宫颈表面坏死、出血的患者亦不适用；4)宫颈活体组织检查：该方法属于有创性检查，操作较复杂，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发一种无创的可靠的新型宫颈癌标识物和检测技术，提高宫颈癌早癌检出率，改善宫颈癌治疗效果，降低宫颈癌死亡率。

表观遗传学是指基因的核苷酸序列不发生改变而基因表达发生了可遗传的变化，是近年来肿瘤研究的热点领域，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明宫颈癌与其他多种癌症一样，是由多种致癌因素长期作用的结果，其病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。