[发明专利]一种基于多孔纳米级温敏软胶体的细胞大规模培养的方法

说明书

本发明属于生物医学材料技术领域，具体是一种基于多孔纳米级温敏软胶体的细胞大规模培养的方法。本发明方法以多孔纳米级温敏软胶体与细胞或组织培养物混合，液态输送至中空柱反应器中，在32‑37℃条件下固化进行培养。本发明培养方法，细胞洗脱过程不需要胰酶消化对细胞没有任何影响，而且方便扩增到更多级别的反应器中。一般第一级的细胞扩增后密度可以达到10⁸每毫升，通过温度变化使胶体载有细胞一同消化下来，重复之前接种的做法将细胞输入进其他反应器中，以实现扩增，或者扩大中空柱腔体的直径以达到扩大体积的做法，通过扩大中控纤维柱的数量来实现工艺放大，培养体积放大。

技术领域

本发明属于生物医学材料技术领域，具体涉及一种用于基于多孔纳米级温敏软胶体和中空柱的细胞大规模培养的方法，可以较大面积的3D培养动物干细胞或其他组织细胞。

背景技术

随着现代医学的发展，对动物干细胞或其他组织细胞的大规模扩增需求越加旺盛。使用CHO细胞表达单克隆抗体的生物制药行业已经使得悬浮培养细胞的工艺非常成熟，实现了数以万升级别的商业化生产。培养CHO细胞的设备也随着技术的进步不断的扩增到万升级别。但是这些系统有着他们的局限性。例如，大部分贴壁细胞无法直接悬浮在10L以上体积的反应器内。大部分用于细胞治疗的原代组织细胞无法直接在悬浮培养体系下扩增，而即使扩增其细胞特征标志物的表达也差异极大，给治疗的效果和安全性代来很大的调账。另外，即使使用微载体工艺，多次扩增过程中的消化工艺也会对细胞代来极大的损伤。因此，可以归纳总结为，适用于传统的悬浮培养反应器并一定适用于干细胞或其他特定的组织细胞。

在CarT细胞治疗，干细胞治疗和未来的组织工程治疗中的细胞扩增密度一般在10⁷-10⁸每公斤的量级，即人体的一次临床注射需要10⁹到10¹⁰次方级别的细胞。传统的培养方式主要有贴壁细胞培养和3D液态细胞培养。贴壁细胞培养一般为常规实验室的方瓶培养或使用商业化的多层细胞工厂进行，但是一方面由于细胞只生长在一个平面上，因此培养的利用面积非常有限，往往每平方厘米范围内只能有10⁴级别的细胞，如果要达到10⁹-10¹⁰级别的细胞数量，需要大量的细胞工厂货细胞板堆叠，需要大量的人工和检测工作，而且一旦感染其他病毒或微生物对病人来说都是致命的。除此之外平板培养属于2D培养，没有类似动物体内3D的组织结构，因此多项研究表面2D培养条件下，很多干细胞没有在动物体内培养的生物特征标记物，在某些基因表达上也存在很大的差异，会使得细胞治疗的效果大打折扣。第二种传统的培养方式为悬浮培养，比如滚瓶，摇瓶或类似Wave波浪式反应器等小型剪切力可控的生物反应器，该种方法的优点在于大大的扩增了三维的培养空间，因此其细胞密度可以大大提高，但是由于悬浮培养一般都带来流体的剪切和空气气泡对细胞代来的剪切伤害，治疗用的干细胞或组织往往都是原代细胞，对流体或者空气气泡代来的剪切极其的敏感，因此也有学者指出在该种环境下生长的细胞也会丢失一些生物特征标记物或在基因表达上显现出差异。此外，行业中也有不少微载体工艺的应用，先将干细胞或组织细胞先贴附在微载体上，然后在进行悬浮培养，微载体表面一般与细胞表面进行化学键或物理键的连接。微载体的培养工艺有效的处理了流体和气泡的剪切力对细胞的影响，使得细胞在一定程度上适应了反应器内液态悬浮培养的条件。但是微载体工艺的弊端在于细胞与微载体的分离往往都需要复杂的工艺。据应用最为广泛的美国通用电气推出的cydexII微载体，就需要用胰酶或其他化学药剂进行消化，而消化的过程往往会对细胞代来严重的伤害。而在细胞扩增，逐级放大的过程中细胞需要经历若干次的消化，细胞的受损严重，因此此种工艺一般只能应用在较小体积范围内。