[发明专利]一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白及其应用

说明书

本发明属免疫生物学领域,提供了一种截短表达的支气管败血波氏菌BcfA重组蛋白及其制备方法和应用,通过截短表达提高BcfA重组蛋白的表达量和可溶性。对BcfAN端373位氨基酸残基之后的序列进行了克隆和表达，截短后的BcfA的表达量提高了10倍，且主要为可溶性表达。Western blot结果显示，截短表达后的BcfA依然与支气管败血波氏菌感染康复血清反应明显。免疫保护力实验表明BcfA的截短表达重组蛋白依然对支气管波氏败血波氏菌表现出良好的免疫保护作用。通过截短表达提高了BcfA重组蛋白的表达量和可溶性，为后期研制以BcfA重组蛋白抗原为基础的基因工程疫苗奠定了基础。

技术领域

本发明属免疫生物学领域，具体涉及一种截短表达的支气管败血波氏菌BcfA重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

支气管败血波氏菌（Bordetella bronchiseptica）是一种能感染多种哺乳动物、引起动物发生鼻炎和肺炎的革兰氏阴性细小杆菌。此菌以犬、猪及兔的感染最为普遍，常导致犬传染性支气管炎、猪传染性萎缩性鼻炎和兔支气管败血波氏菌病。此外，支气管败血波氏菌和其他病原体之间存在协同作用，从而增加其他原发性和继发性病原体引起的呼吸道疾病的严重程度，对养殖业造成较大经济损失。此外，也有报道支气管败血波氏菌感染人的报道。

目前已经研制或有报道的支气管败血波氏菌病疫苗主要包括灭活疫苗、弱毒疫苗和亚单位疫苗三种。与灭活疫苗和减毒活疫苗相比，亚单位疫苗具有安全、稳定和可以借助基因工程手段大量生产的优点，正成为兽用疫苗研究的重要方向。支气管败血波氏菌的波氏菌克隆因子A（Bordetella colonization factor A， BcfA）蛋白是一种和细菌定殖有关的外膜蛋白，具有良好的免疫保护力，是支气管败血波氏菌亚单位疫苗研制的重要候选抗原。但是BcfA重组蛋白的表达量不高，而且主要以包涵体形式表达，这就不利于其临床应用。本研究的目的是通过对BcfA进行截短表达，从而获得一种表达量高、可溶性好、且较好地保留了原BcfA全长蛋白免疫活性的重组蛋白。

发明内容

本发明所解决的技术问题是：通过对BcfA进行截短表达，从而获得一种表达量高、可溶性好、且较好地保留了原BcfA全长蛋白免疫活性的重组蛋白，从而应用于支气管败血波氏菌病疫苗的制备。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：提供一种用作一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白，所述重组蛋白其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

其中，编码所述一种用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

优选的，所述重组蛋白可以添加His、GST标签，便于纯化和鉴定。

所述用作支气管败血波氏菌病疫苗的重组蛋白的制备方法，其步骤如下所示:

(1)通过PCR扩增BcfA的第373位到第968位氨基酸所对应的DNA序列；

(2)将步骤(1)得到PCR产物连接到骨架质粒上，得到表达载体；

(3)将步骤(2)得到的表达载体转化到宿主菌中诱导表达后，经提取纯化即得到重组蛋白。

优选的，所述步骤（1）中PCR扩增所采用的引物序列为：373T-F：cagcaaatgggtcgcggatccACGATCGCGCGCGTCGATAC和373T-R：gcaagcttgtcgacggagctcGTGAAGCAAGCCATCCACG，用于扩增截短的BcfA。

优选的，所述步骤（2）和（3）是通过包括下述步骤的方法实现的：将BcfA的PCR扩增片段整合到骨架质粒PET28a（+）上获得表达载体，然后将整合成功的表达载体转入BL21宿主菌获得重组菌，采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组菌，表达后用超声波破碎仪器进行破碎后，使用Ni磁珠纯化BcfA重组蛋白。