[发明专利]一种催化活性提高的纤维小体及其组装方法和应用

说明书

本发明公开了一种催化活性提高的纤维小体及其组装方法和应用，属于生物技术领域。本发明利用大肠杆菌分别异源表达含对接模块的木聚糖酶AExynM‑Doc1以及含对接模块的葡聚糖酶EG1‑Doc2；利用酿酒酵母表面展示粘连蛋白Coh1‑Coh2，获得重组酵母EBY100/Coh1‑Coh2；将重组蛋白AExynM‑Doc1、EG1‑Doc2与重组酵母EBY100/Coh1‑Coh2混合，通过AExynM‑Doc1、EG1‑Doc2分别与Coh1、Coh2的结合，完成纤维小体的体外组装。本发明将具高催化活性的木聚糖酶、葡聚糖酶结合在纤维小体的脚手架蛋白中，大大提升了两种酶之间的协同催化作用，从而可以更有效地降解木质纤维素。

技术领域

本发明涉及一种催化活性提高的纤维小体及其组装方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

木质纤维素约占到地球总生物量的50％，但大部分被燃烧或废弃，这样既造成了环境污染，同时又浪费了资源。利用现代生物技术将其转化为生物乙醇或化工原料，不仅可以使人类摆脱对化石燃料的依赖，而且可以减少环境污染，促进社会的可持续发展。木质纤维素生物转化的关键是将纤维素或者半纤维素降解为可发酵的糖，在传统工艺中，通常是由多种商品化酶协同作用完成的，而酶制剂的花费可占到生产成本的20％，严重阻碍了木质纤维素生物转化的发展。因此，亟待开发一种高效经济的解决方案。

近年来，从厌氧微生物中发现了一种可持续、高效降解木质纤维素的多酶复合体--纤维小体(Cellulosome)，该结构由不同酶蛋白按照一定的比例，依靠脚手架蛋白组装而成，可灵活调控酶蛋白的种类和表达量。纤维小体的脚手架蛋白由多个粘连模块(Cohesin domain，Coh)构成，酶蛋白则通过酶亚基上的对接模块(Dockerin domain，Doc)与粘连模块相互作用(主要是疏水作用，辅以少量的氢键)，特异性地结合到脚手架上。当纤维小体结合底物后，除了酶组分之间的协同催化效应外，纤维小体还会促发酶-酶邻近效应及酶-底物-细胞复合协同效应，从而使纤维小体具有比游离酶更强大的底物降解能力。鉴于纤维小体是一种高效降解木质纤维素的多酶复合体，可知其在木质纤维素生物转化中具有巨大的应用潜力，但目前分离得到的产纤维小体的微生物种类有限，且所获得的菌株通常为厌氧微生物，如从反刍动物瘤胃内分离得到的黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)和白色瘤胃球菌(R.albus)，它们的培养条件十分苛刻，难以满足工业化生产的要求。若采用基因重组技术对纤维小体组分蛋白进行体外组装，构建人工纤维小体，可灵活调控木质纤维素降解酶的种类和表达量，从而达到充分降解木质纤维素的目的。

目前，利用酿酒酵母细胞表面展示纤维小体的研究已经取得了一定的研究成果，但人工纤维小体的催化活性依旧不高。因此寻找有效的途径和方法，优化纤维小体组分蛋白以提高催化活性，对木质纤维素的综合利用是至关重要的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种催化活性提高的纤维小体及其组装方法，从而可以有效地降解木质纤维素。

为解决上述技术问题，本发明提供一种催化活性提高的纤维小体，在细胞表面利用纤维小体的脚手架蛋白结构结合高活性的木质纤维素降解酶：所述的细胞为酿酒酵母，所述的脚手架蛋白主要包括来自黄色瘤胃球菌的两种粘连蛋白Coh1、Coh2，所述的木质纤维素降解酶为含对接模块的木聚糖酶AExynM-Doc1以及含对接模块的葡聚糖酶EG1-Doc2。

本发明还提供一种上述的催化活性提高的纤维小体的组装方法，包括：

木质纤维素降解酶基因融合在对接蛋白基因的N末端：通过重叠PCR获得融合基因AExynM-Doc1，并将其插入pET-32a(+)载体，获得重组质粒pET-32a(+)-AExynM-Doc1；通过重叠PCR获得融合基因EG1-Doc2，并将其插入pET-32a(+)载体，获得重组质粒pET-32a(+)-EG1-Doc2；