[发明专利]一种复杂样品中细菌的快速检测方法

说明书

本发明公开了一种复杂样品中细菌的快速检测方法，属于分子生物学技术领域。所述方法包括：(1)将待测样品加入到含有溶菌酶的环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，室温下形成水凝胶；(2)将水凝胶体系置于恒温条件下进行等温扩增反应；(3)利用荧光成像技术分析等温扩增反应后的水凝胶体系中的荧光信号，计算出待测样品中的目标细菌浓度。本发明将LAMP反应体系从以往的溶液态创新性地转变为水凝胶态，进行LAMP原位扩增，水凝胶中的众多纳米孔洞可以起到隔离有机质、重金属等抑制剂的作用，从而实现细菌的绝对定量分析，为真实复杂样品中细菌检测提供了一种价格低廉，操作灵活简洁的数字核酸检测技术。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种基于纳米多孔水凝胶体系的环介导等温扩增方法快速检测复杂样品中的细菌。

背景技术

传统的致病菌检测通过细菌培养来实现定量测定，但它们的操作时间过长并且在识别某些物种方面存在局限性。核酸扩增反应可以将检测时间缩短到几个小时，如环介导等温扩增反应(LAMP)，是一种新型的等温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6-8个区域设计4-6种特异引物，在链置换DNA聚合酶的作用下，65℃恒温扩增并可在60分钟左右实现10⁹倍的核酸扩增，该方法具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。与此同时，反应析出大量的白色焦磷酸镁沉淀，利用这个特点，实验人员可以通过观察反应体系的浑浊程度或者荧光强度来判断结果是阴性还是阳性。基于以上特点，LAMP在细菌检测等方面有着广泛的应用前景。

但是当LAMP直接被用来检测真实复杂样品时，扩增反应容易被真实复杂样品中的有机质、重金属等抑制剂所抑制，造成反应结果假阴性且无法成功检测。现有的核酸扩增技术扩增前通常需要耗时费力的样品预处理步骤，例如DNA提取和纯化，特别是未经处理的真实复杂样品。另外，核酸扩增技术扩增需要昂贵的仪器来进行实时荧光测量，难以进行细菌数目的绝对定量分析，并且不适用于低成本的现场操作和精确的定量分析。

公布号为CN111549147A的中国发明专利申请文件公开了一种细菌快速检测方法及试剂，以细菌的16S rRNA或其PCR扩增产物作为测定靶标，设计捕获探针和检测探针；将附着有16S rRNA或其PCR扩增产物的捕获探针的微球、检测探针以及经细胞裂解处理的待测样品混合；检测复合物中不同微球的微球识别信号以及可检测标记物，从而确定待测样品中各待测细菌的存在与否以及存在的量，使检测变得更快、更简便、更合理，成本低廉，检测效果良好。但是该非数字化检测方法只能作为一种简单的判定手段，无法进行准确定量检测，且无法对未经过预处理的真实复杂样品进行直接快速检测。

近年来，数字核酸检测技术发展迅速，该技术通过将单个细菌核酸分子分隔在单个隔室中并进行独立的核酸扩增反应以鉴定目标核酸的绝对准确浓度。更高的特异性和准确度，更好的变异分析能力以及终点检测和绝对定量等性能使数字化扩增技术在各种检测中得以扩展。

现有的基于微流控芯片阵列反应室的数字化环介导等温扩增方法(digitalLAMP)的设计和使用成本相对较高，可扩展性有限，更重要的是微流控装置加工过程过于繁琐，而且价格昂贵，难以一次性使用，且该方法也有低亮暗比、容易受抑制剂影响等缺点。因此，迫切需要开展一种具有技术稳定，操作简单灵活，成本低廉的数字量化检测方法来快速检测真实复杂样品中的细菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够对真实复杂样品如全血、奶茶等中的细菌进行直接快速检测的方法，克服复杂样品中有机质、重金属等抑制剂的作用，实现细菌的绝对定量分析。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种复杂样品中细菌的快速检测方法，所述复杂样品为含有有机质或金属离子的混合物，所述检测方法包括以下步骤：

(1)将待测样品加入到含有溶菌酶的环介导等温扩增反应体系溶液中，再往反应体系中加入水凝胶单体，室温下形成水凝胶；所述环介导等温扩增反应体系包括特异性扩增目标细菌DNA的引物；