[发明专利]一种细胞色素P450环氧酶及其应用

说明书

本发明公开了一种细胞色素P450环氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP，通过在大肠杆菌中表达所述环氧酶CytP，利用全细胞转化法，将降冰片烯转化为环氧降冰片烷。并从反应的pH、温度、相比和诱导时间等因素对CytP酶的两相催化体系进行优化，克服了之前P450单加氧酶环氧化活性低且催化特异性差的局限，可使得环氧降冰片烷产量达到36.81g/L，催化特性达到99％，环氧化反应摩尔产率达31.46％。从而大大降低了之前的底物成本和环境污染等问题，为环氧降冰片烷的工业化生产和绿色生产奠定了基础。

技术领域

本发明涉及一种细胞色素P450环氧酶及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

环氧降冰片烷，又名3-环氧丙基[3,2,1,0^2,4]辛烷，属于降茨烷的衍生物之一。作为一个饱和的桥环化合物，其化学式为C₇H₁₀O，熔点为126℃。它是由环己烷的碳骨架在1，4位桥连一个亚甲基，同时2，3位与一个氧原子构成环氧结构形成的。

目前，环氧降冰片烷的主要生产方法为化学合成法，主要为过氧化氢法，但是这种方法虽然得率高，能耗却较大，同时会对环境产生毒害作用，不符合绿色生产、安全生产和可持续发展的要求。通过生物法制备环氧降冰片烷具有产品质量稳定安全、工艺条件温和、高效、环保等特点，可以减轻环境和资源压力，因此迫切需要一种有效的生物法高效制备环氧降冰片烷。

目前，微生物法生产环氧降冰片烷涉及到一个关键的酶细胞色素P450环氧酶(CytP，Cytochrome P450 epoxidase)，它具有广泛的底物杂泛性，可以催化降冰片烯，使其C＝C双键环氧化，形成环氧降冰片烷。而微生物法制备环氧降冰片烷主要为酶转化法。目前，由于酶转化法具备环境有利、反应温和及操作简便等优点而更具备工业应用价值。但是，酶转化法大规模制备环氧降冰片烷受到以下限制：(1)底物降冰片烯不溶于水，反应体系中有机溶剂的加入对CytP存在抑制作用；(2)过氧化氢作为反应物之一为产物提供氧原子，进一步对酶活造成不可逆的损失；(3)伴随着催化反应的进行，CytP强大的催化能力和底物杂泛性使得副产物生成，导致催化特异性降低，这极大程度限制了环氧降冰片烷的产率及后期分离纯化，是目前研究的重点问题。此外，如ShengxiJin，Thomas M,Makris等人所研究的P450酶的烯烃环氧化反应机理报道，P450酶作为加氧酶，当底物存在C＝C双键时，更偏向于催化羟基化反应，而环氧化反应一直是不被期望的转化率低的副反应(公开于《Epoxidation of Olefins by Hydroperoxo-Ferric Cytochrome P450》，2003年)。为实现环氧化反应，P450酶往往需要对特定的关键残基进行突变改造，而专一性催化环氧化反应更是一项挑战。

发明内容

在目前的研究中，P450环氧酶中的大部分酶都不能够对底物实现单一性的催化环氧化，导致催化效率低、产量极低。

近年来，细胞色素P450酶催化路径的深入研究为催化单一环氧化反应提供了新思路

——CouplingⅡ分流途径。区别于P450酶经典的羟基化单加氧途径，CouplingⅡ分流途径既不需要额外的氧化还原蛋白伴侣也不需要NAD(P)H辅因子，过氧化氢作为该途径中唯一的氧来源，最终产生单一的环氧化产物。CouplingⅡ分流途径为P450酶转化法制备环氧降冰片烷打通了催化特异性低下的壁垒。

但是发明人在前期的研究中发现，在庞大的P450酶系中，并不是所有的酶都能催化降冰片烯生成环氧降冰片烷。

因此，本发明提供了一种细胞色素P450环氧酶CytP，并利用该环氧酶催化降冰片烯制备环氧降冰片烷。利用该环氧酶CytP构建重组菌，进行全细胞法转化生产环氧降冰片烷，具有低环境损害、高催化特异性、减少了转化中的副产物等优点，极大提高了工业化的生产效率。