[发明专利]一种检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-PCR试剂及方法

说明书

本发明提供一种用于检测和区分甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS‑CoV‑2的冻干型多重荧光RT‑PCR试剂及方法。本发明提供的甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS‑CoV‑2荧光RT‑PCR检测试剂所用的引物及探针是基于公众基因序列数据库最新的甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS‑CoV‑2的基因序列信息设计、筛选而得出，具有良好的包容性、特异性及反应性能。该试剂采用人RNase P核酸片段作为检测内标。另外，本发明通过冷冻干燥技术将甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS‑CoV‑2荧光RT‑PCR检测试剂制成可常温保存的冻干型试剂，避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，降低了运输和管理成本。

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术，具体涉及甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的核酸检测。

背景技术

呼吸道感染是人类最常见的一类疾病，是引起人群发病和死亡的最主要原因之一。研究表明，呼吸道病毒是引起呼吸道疾病的最常见的病原体。呼吸道病毒包括流感病毒、冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒、人偏肺病毒、腺病毒等。呼吸道病毒感染引起的临床表现都较为相似，主要有鼻炎、咽炎、喉炎、扁桃体炎、气管炎、支气管炎、肺炎、咳嗽、呼吸困难、发烧、乏力等，但不同病原体引起的感染，其治疗方法、疗效和病程也不尽相同。

流感病毒是引起流行性感冒的病原体。流感病毒属正粘病毒科，分为甲型、乙型、丙型和2016年首次发现的丁型。流感病毒的基因组由七或八条负链RNA 节段构成，每条RNA编码一或两个蛋白。其中甲型流感病毒根据病毒颗粒外膜血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)蛋白抗原性的不同，可分为16个H亚型(H1-H16) 和9个N亚型(N1-N9)，由于编码HA和NA的核苷酸序列容易发生突变，令HA 和NA的抗原表位发生改变，致使人群原有的特异性免疫力失效，故甲型流感病毒常引起较大规模的流行。乙型流感病毒主要分成Victoria系与Yamagata系，抗原变异较小，可引起流感的局部爆发。丙型极少引起流行，丁型暂未见流行报道。在医疗卫生领域，对甲型和乙型流感病毒的诊断和监测最为重要。

冠状病毒是另一大类重要的呼吸道病毒。冠状病毒属于套式病毒目、冠状病毒科，可分为α、β、γ、δ四个属，基因组均由线性单股正链的RNA组成。目前已发现7种可感染人类的冠状病毒，即α属的HCoV-229E和HCoV-NL63，以及β属的HCoV-OC43、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2。其中 SARS-CoV-2是引发当前新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情的病原体，与蝙蝠类SARS冠状病毒(Bat SARS-like coronavirus)和SARS-CoV有最接近的亲缘关系。COVID-19能引起和流行性感冒相似的肺炎、咳嗽、发烧、乏力等症状，所以在临床诊断和疫情防控上，区别SARS-CoV-2和流感病毒具有重要意义。

荧光RT-PCR技术以特定的呼吸道病毒基因序列为检测目标，对来源于人体样本中的呼吸道病毒核酸进行体外定性检测。荧光RT-PCR因其准确、灵敏、快速等特点，已被越来越多地应用于临床上辅助诊断呼吸道病毒感染相关疾病，是目前COVID-19主要确诊方法。但是，常规荧光RT-PCR检测试剂均为液体试剂，需要在-20℃以下保存才能保持检测活性，保存、运输和使用过程中的温度升高、反复冻融都会降低试剂的检测性能。特别是在疫情期间交通运输受阻，冷链运输条件难以保障，长途运输时试剂失效的风险及冷链管理成本大大增加，不能适应国际长途运输及冷链条件较差的基层检测机构的应用。

此外，由于全球疫情爆发，不同地区分别进入冬季流行性感冒季节，由于流感与COVID-19的早期症状相似，给疫情控制带来更大的挑战。市场急需一种能准确检测和区分流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2的荧光RT-PCR检测试剂。

发明内容

本发明的目的是：提供一种可准确检测和区分甲型流感病毒、乙型流感病毒及冠状病毒SARS-CoV-2，且无需冷链的多重荧光RT-PCR检测试剂及方法。