[发明专利]一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。该高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株通过基因编辑技术在产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A中插入TKS和OAC酶得到。本发明通过基因编辑技术调控2，4‑二羟基戊苯合成酶TKS和2,4‑二羟基戊苯酸合成酶OAC的基因拷贝数，增加OLA的积累量。最终，平衡大麻萜酚酸合成前体GPP和OLA的代谢流量，达到高产大麻萜酚酸的目的。

技术领域

本发明涉及合成生物学技术领域，通过基因工程改造，获得一株高产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母菌株，特别是涉及一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

背景技术

无致幻副作用的大麻萜酚(Cannabigerol,CBG)在医药、食品、保健和化妆品等领域有重要的应用价值。CBG与人体CB1和CB2受体结合后行使诸如抗肿瘤、抗炎症、抗氧化、保护神经、免疫调节及治疗癌症等功效。同时，CBG还对甲氧西林耐药性的金黄色葡萄菌有杀菌效果。在大麻植物腺毛的基盘细胞中，液泡中聚酮化合物途径利用脂肪酸合成二羟基戊苯酸(Olivetolic acid,OLA)，质体中的甲羟戊酸途径利用乙酰基辅酶A合成牻牛儿焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)。进一步，香叶基转移酶将GPP和OLA缩合形成大麻萜酚酸(cannabigerolic acid,CBGA)。大麻萜酚酸经过脱羧处理后获得大麻萜酚产物。2006年，Taura等从C.sativa中鉴定了植物来源的二羟基戊苯合酶(Olivetol synthase,OLS)，其在OLA合成途径中被命名为TKS。Gagne等鉴定出了OLA环化酶(OLA cyclase,OAC)(Gagne etal.,2012)。在酿酒酵母中以己酰辅酶A为前体，TKS(Taura等鉴定的OLS酶)和OAC酶可合成了0.5mg/L OLA。2016年，Kathleen等从大麻植物Cannabis sativa L.的腺毛cDNA中扩增到具有GPP:OA异戊烯转移酶功能的蛋白PT3。利用酿酒酵母底盘细胞合成GPP的特点，可在酿酒酵母体内表达异戊烯转移酶和OLA合成途径获得大麻萜酚酸产物。

但是，现在现有技术中存在以下几个问题：第一，在酿酒酵母中不能协调大麻萜酚酸合成途中的代谢前体GPP和OLA的合成量，最终导致大麻萜酚酸产量低的问题；第二，不能在酿酒酵母中大量积累OLA代谢产物用于合成大麻萜酚酸。

因此，市面上亟需一种能够解决上述一个或者多个问题的一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

发明内容

为解决现有技术中存在的一个或者多个问题，本发明提供了一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用。

本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株的构建方法，所述方法包括：

步骤01、构建一株产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A；

步骤02、通过基因编辑技术在产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A中插入TKS酶和OAC酶，获得高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B。

在一些实施例中，所述方法还包括：

步骤03、在高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B中筛选OAC酶的表达启动子获得最佳表达启动子，并利用最佳表达启动子插入2个拷贝数的OAC基因，获得高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株C。

在一些实施例中，所述步骤02包括：

步骤21、以产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A为基础，通过引物F1/R1进行PCR扩增得到1622位点上游1000bp同源臂片段1622b-Up，引物F2/R2进行扩增获得融合的TKS-OAC片段，引物F3/R3进行扩增获得1622b位点下游1000bp同源臂片段1622b-Down；

步骤22、通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述3个片段转化产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A；