[发明专利]一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤01、构建一株产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A；

步骤02、通过基因编辑技术在产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A中插入TKS酶和OAC酶，获得高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B。

2.根据权利要求1所述的高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述方法还包括：

步骤03、在高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B中筛选OAC酶的表达启动子获得最佳表达启动子，并利用最佳表达启动子插入2个拷贝数的OAC基因，获得高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株C。

3.根据权利要求1或2所述的高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤02包括：

步骤21、以产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A为基础，通过引物F1/R1进行PCR扩增得到1622位点上游1000bp同源臂片段1622b-Up，引物F2/R2进行扩增获得融合的TKS-OAC片段，引物F3/R3进行扩增获得1622b位点下游1000bp同源臂片段1622b-Down；

步骤22、通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述3个片段转化产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A；

步骤23、利用CRISPR-Cas9基因编辑工具，在基因序列为

TAAAGCCACCACATCGCAAA的gRNA的引导下对1622b位点进行双链断裂切割DNA；

步骤24、产大麻萜酚的酿酒酵母菌株A内的同源重组酶将1622b-Up、TKS-OAC和1622b-Dp三个片段连接成一个片段，最后通过位于TKS-OAC两端的1622b-Up和1622b-Dp同源臂，在1622b位点整合TKS-OAC表达框；

步骤25、通过营养缺陷性的组成培养基筛选转化阳性克隆获得高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B。

4.根据权利要求3所述的高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，每个PCR扩增的片段之间包含50bp的同源臂序列。

5.根据权利要求2所述的高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，所述步骤03包括：

步骤31、以高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B为基础，通过引物F5/R5进行PCR扩增得到YPRCd15c位点上游1000bp同源臂片段YPRCd15c-Up，引物F6/R6进行扩增获得表达启动子pTDH3，引物F7/R7进行扩增获得OAC-ENO1t编码序列，引物F8/R8进行扩增获得YPRCd15c位点下游1000bp同源臂片段YPRCd15c-Down；

步骤32、通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述4个片段转化为高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B；

步骤33、利用CRISPR-Cas9基因编辑工具，在基因序列为

AATCCGAACAACAGAGCATA的gRNA的引导下对YPRCd15c位点进行双链断裂切割DNA；

步骤34、高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株B内的同源重组酶将上述4个片段连接成1个片段，最后通过位于OAC表达框上下游的YPRCd15c-Up和YPRCd15c-Dp同源臂，在YPRCd15c位点整合TKS-OAC表达框；

步骤35、通过营养缺陷性的组成培养基筛选转化阳性克隆获得高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株C。

6.根据权利要求5所述的高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，每个PCR扩增的片段之间包含50bp的同源臂序列。

7.一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株通过权利要求1所述的构建方法构建而成。

8.一种高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株，其特征在于，所述高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株通过权利要求2所述的构建方法构建而成。

9.一种权利要求7或8所述的高产大麻萜酚的酿酒酵母菌株在产大麻萜酚酸中的应用。