[发明专利]一种羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法

说明书

本发明提供了一种羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法，包括如下步骤：(1)对质粒和质粒载体进行双酶切，将得到的VHH基因片段与质粒载体进行连接形成重组质粒，然后将所述的重组质粒电转化入大肠杆菌感受态细胞中进行纳米抗体的表达，纯化得到的纳米抗体蛋白；(2)双抗夹心ELISA方法的构建：在捕获抗体中加入羽扇豆总蛋白，使其与捕获抗体结合，然后加入检测抗体，鼠抗HA单克隆抗体为一抗，HRP标记的单克隆抗体为二抗，进行显色后即成。本发明所述的羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法基于特异性的纳米抗体，能够开发食品中痕量过敏原的高灵敏快速检测体系，用于食物组分中过敏原检测。

技术领域

本发明属于免疫检测领域，尤其是涉及一种羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法。

背景技术

传统食物过敏原组分的免疫检测技术开发基于单克隆或多克隆抗体的筛选与制备，其要求在动物免疫过程中注射高纯度过敏原蛋白，并且筛选和制备抗体周期较长。在驼源动物外周血液中天然存在一种重链抗体(Heavy Chain only Antibodies,HCAbs)，与传统单克隆抗体相比，重链抗体天然缺失轻链及重链第一恒定区(CH1)。克隆并表达重链抗体的重链可变区得到重链抗体的抗原识别和结合域，称为纳米抗体(Nanobody,Nb)。纳米抗体具有与原重链抗体相当的结构稳定性及抗原结合活性，是目前已知的可结合靶向抗原的最小抗体单位。针对传统免疫过程需要制备高纯度过敏原蛋白，并且传统单克隆抗体制备周期长，成本高，与传统单克隆抗体片段相比，纳米抗体存在诸多优势，纳米抗体制备周期短，成本低，稳定性高。纳米抗体可溶性极高，不易发生聚集沉淀，具有很高的稳定性，能够在高温、强酸、强碱等致变性条件下保持抗原结合活性，适合于原核及真核表达系统。目前，纳米抗体被广泛应用于开发治疗性抗体药物、诊断试剂(胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法)、亲和纯化基质、免疫学研究等基础科学研究领域。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法。

为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法，包括如下步骤：

(1)纳米抗体的制备及筛选：分别使用限制性核酸内切酶PstⅠ和BstⅡ对质粒和质粒载体进行双酶切，将得到的VHH基因片段与质粒载体通过T4 DNA连接酶进行连接形成重组质粒，对重组质粒进行纯化，然后将纯化后的重组质粒电转化入大肠杆菌感受态细胞中进行纳米抗体的表达，纯化得到的纳米抗体蛋白；

(2)双抗夹心ELISA方法的构建：在捕获抗体中加入羽扇豆总蛋白，使其与捕获抗体结合，然后加入检测抗体，鼠抗HA单克隆抗体为一抗，HRP标记的单克隆抗体为二抗，进行显色后即成。

进一步，得到所述的纳米抗体蛋白后将带有His标签的纳米抗体作为捕获抗体，带有His和HA标签的纳米抗体作为检测抗体。

进一步，所述的捕获抗体的浓度为7.5mg/ml，检测抗体的浓度为7.5mg/ml。

进一步，羽扇豆总蛋白的最低检测限为1.15mg/L，定量限为29.75mg/L。

所述的羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法的用途，所述的方法在制备检测试剂盒中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下优势：

本发明所述的羽扇豆过敏原Lupan1的夹心ELISA方法基于特异性的纳米抗体，能够开发食品中痕量过敏原的高灵敏快速检测体系，用于食物组分中过敏原检测。

附图说明

图1为本发明实施例所述的纳米抗体纯化色谱峰值的曲线图；