[发明专利]一种用于检测DNA的免疫层析试纸条及其制备方法

权利要求书

1.一种用于检测DNA的免疫层析试纸条，包括底板和顺次连接在底板上的样品垫、结合垫、测试垫和吸收垫，其特征在于，

所述结合垫上喷涂有检测探针与金纳米棒的偶联物；所述检测探针为5’端巯基修饰的单链DNA；所述检测探针与待检测DNA的核苷酸序列互补配对；

所述检测垫上设置有检测线和质控线；所述检测线上喷涂有捕获探针与链霉亲和素的偶联物；所述捕获探针的3’端经生物素标记；

所述质控线上喷涂有质控探针与链霉亲和素的偶联物；所述质控探针的3’端经生物素修饰；所述质控探针与待检测DNA的核苷酸序列互补配对。

2.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述金纳米棒的长度为20～200nm。

3.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述检测探针与金纳米棒的偶联物的制备方法包括：

在金纳米棒中依次加入dATP、十二烷基硫酸钠水溶液、氯化钠水溶液和检测探针，进行偶联反应，离心，收集沉淀，洗涤，重悬，得到含有检测探针与金纳米棒的偶联物的溶液。

4.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述金纳米棒、dATP、十二烷基硫酸钠水溶液、氯化钠水溶液和检测探针的体积比为：500：5：7.5：25：85；所述dATP的浓度为1mM；所述十二烷基硫酸钠水溶液的质量浓度为1％；所述氯化钠水溶液的浓度为2M。

5.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述偶联反应的反应程序包括：60℃水浴中孵育3h。

6.根据权利要求3所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述重悬采用的试剂包括洗脱缓冲液；所述洗脱缓冲液包括以下质量份的组分：Na₃PO₄·12H₂O 304mg、牛血清蛋白2.0g、蔗糖4.0g、吐温-200.1g和水40g。

7.根据权利要求1～3任意一项所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述金纳米棒的制备方法包括以下步骤：

1)在十六烷基三甲基溴化铵水溶液中加入HAuCl₄水溶液，在搅拌过程中加入NaBH₄溶液，继续搅拌2min，得到金纳米种子溶液；

2)将十六烷基三甲基溴化铵水溶液、HAuCl₄水溶液、AgNO₃水溶液、还原剂和所述金纳米种子溶液混合，进行还原反应，得到金纳米棒。

8.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述捕获探针与链霉亲和素的偶联物的制备方法包括：将捕获探针和链霉亲和素水溶液混合，进行偶联，得到偶联反应液，将所述偶联反应液和浓度为500mg/L的PBS混合，置于截留分子量为30000的样品浓缩管中，6000rpm 20min离心以除去未反应的捕获探针，收集上清液，得到含有捕获探针与链霉亲和素的偶联物的捕获探针溶液；所述捕获探针和链霉亲和素水溶液的比例为50nmol：80μL。

9.根据权利要求1所述的免疫层析试纸条，其特征在于，所述质控探针与链霉亲和素的偶联物的制备方法包括：将质控探针和浓度为2.5mg/mL的链霉亲和素水溶液混合，进行偶联，得到偶联反应液，将所述偶联反应液和浓度为500mg/L的PBS混合，置于截留分子量为30000的样品浓缩管中，6000rpm、20min离心以除去未反应的捕获探针，收集上清液，得到含有质控探针与链霉亲和素的偶联物的质控探针溶液；所述质控探针和链霉亲和素水溶液中链霉亲和素的摩尔比为4：1。

10.权利要求1～9任意一项所述免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

S1.将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，依次固定结合垫、样品垫和吸收垫；

S2.在所述结合垫上吸附检测探针与金纳米棒的偶联物，在硝酸纤维素膜的检测线喷涂捕获探针与链霉亲和素的偶联物，在质控线喷涂质控探针与链霉亲和素的偶联物，得到免疫层析试纸条；所述捕获探针与链霉亲和素的偶联物的喷涂量为0.5～1μL；所述质控探针与链霉亲和素的偶联物的喷涂量为0.5～1μL；所述检测探针与金纳米棒的偶联物的吸附量为8～12cm²。