[发明专利]一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法

说明书

本发明公开一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，包括SEA‑PCRDNA或RNA检测法，以及SEA‑ITA恒温扩增DNA或RNA样品检测法；本发明建立SEA‑PCR检测和SEA‑ITA恒温扩增检测法，通过修饰底物dNTPαSe或dNTPαS，抑制了检测过程中非特异性产物的产生，增加了反应的特异性、灵敏度、抗干扰性和准确性，简化了引物的设计和实验条件的优化，建立了高效的扩增反应，通过特异性的提高，抑制了检测体系的非特异性扩增，尤其在低浓度核酸DNA或RNA靶标分子的情况下，提高了检测的灵敏度和准确性，从而在临床DNA或RNA样品检测上减少了假阳性率和假阴性率，增加了检测结果的可信度。

技术领域

本发明涉及核酸检测方法领域，尤其涉及一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法。

背景技术

核酸检测是诊断传染病、遗传病和肿瘤等疾病的重要手段，如新冠病毒的检测和诊断，核酸检测方法主要有两大类：一类是传统基于变温的的聚合酶链式反应(PCR)，作为核酸检测的标准方法，其具有灵敏和准确的特点，另一类是反应温度恒定的等温扩增技术(Isothermal Amplification,ITA)，与PCR方法相比，它操作步骤简单，仪器便宜，不需要专业人员，不需要特殊设计检测场所，特别适合即时快速现场检测(point-of-caretesting,POCT)，也适合于经济条件差地区，因此近年来也受到高度关注。

为了有效实施聚合酶链式反应检测特定目标序列，引物序列的设计和反应条件的优化都是非常必要但又很繁琐的工作，而这些优化经常不能得到特异性的聚合酶链式反应扩增，从而导致经过多个循环后，PCR经常产生大量非特异性的DNA片段，进而降低了反应的扩增效率，现有的提高PCR反应特异性和稳定性的方法非常耗时耗力，而且当PCR反应涉及到多对引物时，如多重PCR，这些策略难以改善PCR反应特异性。而对于恒温扩增来说，因为没有温度辅助的准确退火配对过程，通常引物浓度较高，其扩增常常出现非特异性，无法很好地应用到临床检测中，因此，本发明提出一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法以解决现有技术中存在的问题。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提出一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏DNA或RNA核酸检测方法，该方法建立SEA-PCR[Se-enhanced specific amplification-PCR(硒增强的PCR，简称硒PCR)或者S-enhanced specific amplification-PCR(硫增强的PCR，简称硫PCR)]和SEA-ITA恒温扩增[Se-enhanced specific isothermalamplification(硒增强的ITA，简称硒ITA)或者S-enhanced specific isothermalamplification(硫增强的ITA,简称硫ITA)]的检测方法，即是SEA-PCR检测法(变温策略)和SEA-ITA恒温扩增检测法(恒温策略；例如，环介导等温扩增反应，Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)；通过修饰底物dNTPαSe或者dNTPαS，抑制了检测过程中非特异性产物的产生，增加了反应的特异性、灵敏度、抗干扰性和准确性，简化了引物的设计和实验条件的优化；两类修饰底物dNTPαSe和dNTPαS可分别使用于DNA聚合反应(即单类独立使用)，也可以两类以任何方式混合使用于DNA聚合反应(包括RNA反转录)；本发明建立了高效的扩增反应，通过特异性的提高，抑制了低浓度模板下的非特异性扩增，提高了检测的灵敏度和准确性，从而在临床样品检测上减少了假阳性率和假阴性率，增加了检测结果的可信度。而且在ITA技术中，由于修饰底物提高了聚合反应特异性，故SEA-ITA可以在一定反应温度范围下进行，使其可以更好地应用到临床检测中。对DNA样品的检测可以通过DNA聚合酶的催化直接进行。然而，对RNA核酸样品的检测可以通过使用RNA反转录酶(也是一种DNA聚合酶)，来对RNA进行反转录，然后对得到的DNA进行放大检测。