[发明专利]一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法

权利要求书

1.一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：包括变温策略检测法和恒温策略检测法。

2.根据权利要求1所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：所述变温策略检测法包括以下步骤：

步骤一：合成并配置引物

先针对待测DNA或RNA靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，配置成特定浓度使其添加到反应体系后的反应浓度为10nM-100microM；

步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物

用至少一种dNTPαSe或至少一种dNTPαS，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；

步骤三：配置SEA核酸检测反应体系

将PCR缓冲液、至少一个荧光染料或至少一个分子探针、至少一个DNA聚合酶、至少一个正向引物、至少一个反向引物、dNTP混合物、核酸DNA或RNA靶标分子配置成SEA-PCR反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；

步骤四：反应及产物分析

先将配置好的SEA-PCR反应体系放置于PCR仪，最后进行核酸扩增结果的分析。

3.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述变温策略检测法的步骤二中：用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一种或多种，来彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物。

4.根据权利要求1所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：所述恒温策略检测法包括以下步骤：

步骤一：合成并配置引物

先针对待测DNA或RNA靶分子进行引物的设计，再根据引物的设计合成出引物，将其用水溶解，并配置成引物混合物，使其添加到反应体系后的反应浓度为0.01-100microM；

步骤二：配置脱氧核苷三磷酸混合物

用至少一种dNTPαSe或至少一种dNTPαS，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物；

步骤三：配置SEA-ITA恒温扩增反应体系

将扩增缓冲液、引物混合物、至少一个荧光染料或至少一个荧光探针、dNTP混合物、至少一个DNA聚合酶和核酸靶标分子配置成反应体系，并同时设置阳性对照和阴性对照；

步骤四：反应产物分析

先将配置好的反应体系放置于恒温仪中，接着在恒温环境下孵育1-600分钟，最后进行核酸扩增结果的分析。

5.根据权利要求4所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述恒温策略检测法中的步骤二中：用dATPαSe、dCTPαSe、dGTPαSe、dTTPαSe、dUTPαSe和dATPαS、dCTPαS、dGTPαS、dTTPαS、dUTPαS其中的一种或多种，彻底或部分取代与之碱基相同的dATP、dCTP、dGTP和dTTP，并按规定浓度混合成dNTP混合物，接着根据试验需要向反应体系中加入规定量的dNTP混合物。

6.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：所述变温策略检测法，在步骤一中，通过在线软件对引物进行设计，设计的引物包括正向引物和反向引物。

7.根据权利要求2所述的一种基于修饰dNTP的高特异和高灵敏核酸检测方法，其特征在于：在所述变温策略检测法的步骤二中，所述dNTP混合物的浓度均为0.01-100mM。