[发明专利]一种基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M1

说明书

本发明提供了一种基于时间分辨荧光标记‑滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M₁的方法，属于纳米材料与分子生物技术领域。本发明具体方法为：将时间分辨荧光纳米颗粒(KYF₄:Eu³⁺NP)用生物素化的AFM₁特异性适配体的互补链(cDNA)修饰得到KYF₄:Eu³⁺‑cDNA荧光探针，使用g‑C₃N₄纳米片作为荧光猝灭剂，将AFM₁特异性适配体用作滚环扩增的引物，加入滚环扩增模版、T4 DNA连接酶、dNTPs、Phi29 DNA聚合酶经滚环扩增反应后，向体系中加入g‑C₃N₄纳米片，通过监测体系的荧光信号强度，达到定量/定性检测AFM₁的目的。该发明可以用于牛奶等样品中AFM₁的检测。

技术领域

本发明提供了一种基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M₁的方法，属于纳米材料与分子生物技术领域。本发明具体方法为：将时间分辨荧光纳米颗粒(KYF4:Eu³⁺NP)用生物素化的AFM₁特异性适配体的互补链(cDNA)修饰得到KYF4:Eu³⁺-cDNA荧光探针，使用g-C₃N₄纳米片作为荧光猝灭剂。将AFM₁特异性适配体用作滚环扩增的引物，加入滚环扩增模版、T4 DNA连接酶、dNTPs、Phi29 DNA聚合酶等经滚环扩增反应后，向体系中加入g-C₃N₄纳米片，通过监测体系的荧光信号强度，达到定量检测AFM₁的目的。该发明可以用于牛奶等样品中AFM₁的检测。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)是一类由真菌、黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物(双呋喃环类毒素)的总称，广泛分布于自然界中。目前发现的黄曲霉毒素约20多种，其中研究较多的有黄曲霉毒素B₁、黄曲霉毒素B₂、黄曲霉毒素G₁、黄曲霉毒素G₂、黄曲霉毒素M₁及黄曲霉毒素M₂六种。黄曲霉毒素M₁(Aflatoxin M₁，AFM₁)主要存在于乳及乳制品、霉变谷物、含有油脂的干果中及动物的肌肉、尿液、乳汁、血液等中，其中乳及乳制品最容易受到AFM₁的污染，也是AFM1的主要存在场所。当泌乳动物摄入饲料中的AFB₁后，将在动物体内肝微粒体酶作用下经体内循环代谢产生AFM₁并存在于其乳汁、尿液中。黄曲霉毒素的毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药的毒性，是目前公认的最毒的化学致癌物质之一。世界卫生组织国际癌症研究机构(International agency for research on cancer of the worldhealth organization)将AFB₁和AFM₁划分为I类致癌物。由于AFM₁来源广、监控难并且毒性强，因此，迫切需要开发一种灵敏、快速且易于使用的检测策略来测定食品中的AFM₁。

目前，AFM₁检测方法主要有薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、高效液相质谱联用法(HPLC-MS/MS)及基于抗原-抗体免疫识别建立的免疫法等。薄层层析法操作步骤较繁琐，灵敏度及特异性低，已不能满足现代检测的需要。而常用的色谱分析法，样品前处理方法复杂、繁琐，且需要熟练掌握仪器操作技术，不便基层推广。免疫法检测霉菌毒素虽具有灵敏度高、特异性强等优点，但是小分子抗原的制备过程繁琐耗时、成本昂贵，不同批次间抗体存在差异性，储存及使用条件严苛，导致假阳性率高、重复性差。所以开发一种快速方便、稳定性好、灵敏度高、特异性强、成本低廉的检测方法很有必要。