[发明专利]一种基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M1

权利要求书

1.一种基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M₁的方法，其特征在于，所述具体方法如下：

S1：将KYF₄:Eu³⁺NP时间分辨荧光纳米用生物素化的AFM₁特异性适配体的互补链(cDNA)修饰得到KYF₄:Eu³⁺-cDNA荧光探针；并选用g-C₃N₄纳米片作为荧光猝灭剂；

S2：将AFM₁特异性适配体用作滚环扩增的引物，与滚环扩增模版、T4 DNA连接酶、dNTPs、Phi29 DNA聚合酶混合经滚环扩增反应后得到反应产物，并与S1中所述KYF₄:Eu³⁺-cDNA荧光探针混合孵育，之后向体系中加入g-C₃N₄纳米片并孵育，检测所得体系的荧光信号强度。

2.根据权利要求1所述的基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M₁的方法，其特征在于，S1中所述KYF₄:Eu³⁺-cDNA荧光探针的通过以下方法制备得到：

步骤1、KYF₄:Eu³⁺NP的合成：将充分溶解有KCl、YCl₃、Eu³⁺和聚醚酰亚胺的乙二醇溶液添加到含有NH₄F的乙二醇溶液中，在室温下继续搅拌反应30min，放入高压反应釜中在200℃下反应4h，经室温冷却后，离心收集产物，并将产物用乙醇和水分别洗涤3次，最后得到KYF₄:Eu³⁺NP时间分辨荧光纳米；

步骤2、将步骤1中所得KYF₄:Eu³⁺NP时间分辨荧光纳米颗粒进行亲和素修饰：将浓度为1～2mg/mL的KYF₄:Eu³⁺NP时间分辨荧光纳米溶液与戊二醛在室温下避光震荡活化2h，之后除去未反应的戊二醛，接着用PBS至少清洗三次，然后加入浓度为1mg/mL亲和素并在37℃震荡过夜，反应结束后清洗并取固相，得到亲和素修饰的时间荧光分辨纳米材料AV-KYF₄:Eu³⁺；

步骤3、时间分辨荧光纳米KYF₄:Eu³⁺NP与cDNA结合：将步骤2中制备得到的亲和素修饰的时间荧光分辨纳米材料AV-KYF₄:Eu³⁺分散于PBS缓冲溶液中，并加入生物素化的cDNA，在37℃摇床中孵育12h，收集固相并用PBS至少清洗三次，最终得到所述cDNA修饰的时间分辨荧光纳米KYF₄:Eu³⁺-cDNA荧光探针。

3.根据权利要求2所述的基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M₁的方法，其特征在于，步骤1中所述KCl、YCl₃、Eu³⁺的摩尔比为2：1：0.1。

4.根据权利要求2所述的基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M₁的方法，其特征在于，步骤3中所述cDNA序列为5′-biotin-TCG ACC CCA GCG TCA GAG CAGG-3′。

5.根据权利要求1所述的基于时间分辨荧光标记-滚环扩增信号放大检测黄曲霉毒素M1的方法，其特征在于，S1中所述g-C₃N₄纳米片的制备方法为：将三聚氰胺以2.3℃/min的升温速率在550℃条件下加热4h即得块状g-C₃N₄，将制备得到的块状g-C₃N₄分散在水中，超声16h，将得到的g-C₃N₄分散液离心，以除去残留的未充分剥落的块状g-C₃N₄。