[发明专利]一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mRNA的DNA四棱锥的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mRNA的DNA四棱锥的制备方法，该DNA四棱锥由两条捕获探针和四条带有荧光标记的DNA支撑探针经两步退火反应自组装而成。当目标不存在时，支撑探针的刚性双链使DNA四棱锥保持张开的三维立体结构；而当目标存在时，目标链引发链置换反应，捕获探针离开并捕获目标。与此同时，DNA四棱锥底边单链则自动折叠形成更稳定的发夹结构，带动DNA四棱锥的整体空间结构发生变化。标记在DNA四棱锥的底边两端的Cy3和Cy5随着折叠过程而靠近，直至发生荧光共振能量转移。这项工作提出了可视化检测细胞中特异性mRNA的另一个维度，也可以为其他许多生物分子的检测开辟新的途径。

技术领域

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mRNA的DNA四棱锥的制备方法。

背景技术

肿瘤相关mRNA被广泛用作揭示恶性肿瘤发生、发展和转移信息的特异性生物标志物。因此，细胞中肿瘤相关mRNA的检测对癌症的早期诊断，治疗和预后具有重要意义。迄今为止，人们已经开发了许多方法来检测这些mRNA，例如Northern-blots、微阵列分析、和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）。但是，这些方法不仅费时费力，还需要大量样本细胞，难以实现单细胞的实时检测。基于荧光显微镜的分子成像技术，具有高选择性、高分辨率和非侵入性的特点，已逐渐发展为可视化细胞内基因表达的一般策略，为在细胞水平上检测癌症提供了一种有效的方法。而基于荧光共振能量转移（FRET）的荧光比率型检测方法，可通过信号比率来有效避免产生假阳性结果。因此，将基于FRET的荧光探针与荧光成像技术相结合，已成为生物医学检测研究的热点。

肿瘤标志物C-myc是一种肿瘤发生激活剂，在乳腺癌的发生和发展中起着不可忽视的关键作用。本发明将MCF-7乳腺癌细胞中的C-myc mRNA作为待测目标物，来评估DNA嘴巴的响应能力。

发明内容

为解决上述问题，本发明提出的一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mRNA的DNA四棱锥的制备方法，通过巧妙设计DNA序列，并经过特定的退火程序自组装成具有三维立体结构DNA四棱锥，实现非侵入式的细胞内肿瘤相关mRNA可视化检测，并利用FRET技术的比率型信号检测方式，有效避免了复杂生物样本中假阳性信号的产生。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mRNA的DNA四棱锥，所述DNA四棱锥包括两条捕获探针CP和四条带有荧光标记的DNA支撑探针S1~S4，所述S1~S4引物序列为：

S1: 5'-TCGCT GAGTA AT/Cy3/AAA TCAAC GCCTC AACGT TAGCA AAA GC AAGTGTGGGC ACGCA CACAA AACAC AAATC TG-3'；

S2: 5'-CTATC GGTAG AT/Cy3/AAC GCAGT CAGTG TCAGT CCAGA AAA TA CTCAGCGACA GATTT GTGAA AACAA CTAGC GG-3'；

S3: 5'-CACTG GTCAG AT/Cy5/AAA TCAAC GCCTC AACGT TAGCA AAA CT ACCGATAGCC GCTAG TTGAA AAGGT TTGCT GA-3'；

S4: 5'-CCACA CTTGC AT/Cy5/AAC GCAGT CAGTG TCAGT CCAGA AAA CT GACCAGTGTC AGCAA ACCAA AAGTG TGCGT GC-3'。

上述DNA四棱锥的制备方法包括以下步骤：