[发明专利]一种富含亚全能干细胞来源外泌体原液的制备方法

说明书

本发明提供了一种富含亚全能干细胞来源外泌体原液的制备方法；包括：取新生胎儿胎盘，取胎盘绒毛膜进行培养；制备A液；对细胞进行破碎；离心得B液；制备C液；制备得外泌体；制备得D液；将B液和D液按照体积比1:1‑5进行混合，得E液。将E液进行FGF因子检测，按照5000pg‑10000pg进行浓缩得富含亚全能干细胞外泌体原液。发明方法采用原料为胎盘，由于胎盘绒毛膜来源亚全能干细胞可以向三胚层多系统分化，具有较低的免疫源性，亚全能干细胞外泌体具有亚全能干细胞的特性；众所周知，胎盘为医疗废弃物，本发明利用胎盘制备富含亚全能干细胞来源外泌体原液，实现了变废为宝。

技术领域

本发明属于生物技术领域；尤其涉及一种富含亚全能干细胞来源外泌体原液的制备方法。

背景技术

亚全能干细胞为分化功能仅此于全能干细胞，可分化为不同胚层的组织细胞，其细胞特性为分布在身体的所有组织和器官，可分化为不同胚层的细胞，可分化为不同类型的多能干细胞并在生长发育和新陈代谢中维持这些多能干细胞的平衡。在单克隆细胞水平上通过体内外实验证实：亚全能干细胞能够向三个胚层多系统分化为各种成熟组织细胞，如造血细胞、脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞、上皮细胞、内皮细胞，参与机体多种组织的损伤修复。

外泌体，是一种直径介于40-100nm的囊泡样结构。在电子显微镜下，外泌体由双层磷脂膜包裹，内含丰富的蛋白质以及microRNA等成分，多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方方面面。

干细胞外泌体中含有的细胞因子分子量小，具有较强的渗透性，其可以通过人体的皮肤角质层进入表皮层和真皮层。然后，通过旁分泌的形式作用于细胞，使成纤维细胞分泌的I型、III型胶原、糖性蛋白量的提高、增加血管内皮细胞管状形成率从而使皮肤深层细胞得到激活、滋养和修复，从而起到美容抗衰的作用。可根据靶细胞的需求，改善和修复肌肤，有针对性地参与、调控、激活靶细胞的修复和快速分裂增殖，在细胞层面针对性解决粗糙、松弛个性化护肤问题。

发明内容

本发明的目的是提供了一种富含亚全能干细胞来源外泌体原液的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明公开一种富含亚全能干细胞来源外泌体原液的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：取新生胎儿胎盘，在温度为4-8℃环境下，6小时内运输至实验室，取胎盘绒毛膜使用贴壁发进行培养；

步骤2：将细胞培养至P4，收取P2-P4的细胞培养上清，标记为A液；

步骤3：将P4代细胞消化计数，生理盐水清洗3次，使用细胞破碎仪对细胞进行破碎，按照10万-100万每毫升添加注射用水；

步骤4：将步骤3所得溶液3000rpm离心10分钟，弃沉淀，将上清4000rpm离心10分钟，弃沉淀，将上清标记为B液；

步骤5：将A液3000rpm离心5分钟，弃沉淀，3500rp离心5分钟，弃沉淀，将上清依次使用100μm、0.45μm、0.22μm细胞筛网过滤得C液；

步骤6：使用PBS对超滤管进行预处理，10ml每支，4000g离心10分钟；

步骤7：将C液添加至超滤管，15ml每支，4000G离心30分钟，弃上清，继续添加C液，4000G离心30分，弃上清，直到C液处理完毕，得外泌体。

步骤8：将步骤7所得外泌体使用B液等体积注射用水重悬，得D液。

步骤9：将B液和D液按照体积比1:1-5进行混合，得E液。