[发明专利]GPRC5D蛋白的制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种GPRC5D蛋白的制备方法和应用，该GPRC5D蛋白的制备方法包括如下步骤：优化GPRC5D原始核苷酸序列，基因合成，以合成基因为模板，经PCR反应，获得目的片段；将目的片段连接到质粒基因上，形成重组质粒；将重组质粒直接置于培养体系中进行培养，获得反应产物液；纯化所述反应产物液，获得GPRC5D全长蛋白。与现有技术相比，本发明GPRC5D蛋白的制备方法采用无细胞表达系统制备获得GPRC5D全长蛋白，便于后续作为骨髓瘤的新靶点进行研究试验。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种GPRC5D蛋白的制备方法和应用。

背景技术

G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptors，GPCRs)因能结合和调节G蛋白活性而得。迄今为止，已报道的G蛋白偶联受体有近2000种，是人体中分布最广、地位最重要的膜蛋白受体，介导各种信号通路，具有重大研究价值。

G蛋白偶联受体的肽链结构主要由N末端、7个跨膜α螺旋、3个胞外环、3～4个胞内环以及C末端组成。其中，位于胞外的N端常常被糖基化，位于胞内C端，多表现为磷酸化；7个跨膜的α螺旋反复穿过细胞膜的脂质双分子层。

按照G蛋白偶联受体一级结构的同源性，主要分为A、B、C三个族。其中C族又称为神经递质/钙受体样受体族，一级结构具有以下共同特点：ECL1与ECL2之间以二硫键相连；ICL3很短且高度保守；C末端无棕榈酰化位点，不形成ICL4；TM中的保守氨基酸残基不同于A、B族受体。C族受体又分为5个亚族：谷氨酸受体、C-氨基丁酸(GABA)受体、钙受体、鼻神经外激素受体以及味觉受体。

其中，GPRC5D(G-protein coupled receptor family C group 5member D)蛋白属于C族，具有GABA-B样受体活性。GPRC5D先前在多发性骨髓瘤(MM)患者骨髓细胞中的浆细胞被鉴定发现，然而其蛋白表达谱并不确定。后续有研究显示：GPRC5D在恶性骨髓浆细胞上表达，CD138阳性多发性骨髓瘤细胞上的GPRC5D表达与BCMA表达不具有相关性，这表明GPRC5D在临床上是一个理想靶标，并有望成为研究多发性骨髓瘤的新靶点。

目前，市面上暂时没有包含多次跨膜区域的GPRC5D重组蛋白产品，仅有含1-27aa、256-345aa的片段蛋白产品，但是胞内片段蛋白或胞外片段蛋白在蛋白的活性作用研究及相应药物筛选等应用上具有较明显的局限性。如果能够获得GPRC5D全长蛋白的完整构象，则对于GPRC5D蛋白的结构、活性研究更具有说服力，对于靶向GPRC5D CAR-T治疗多发性骨髓瘤具有较高利用价值，同时也有助于研究该家族其他亚家族成员的结构和活性。

但是，GPRC5D全长蛋白作为多次跨膜的G蛋白偶联受体的一种，不易通过传统方法制备获得，主要原因在于：GPRC5D全长蛋白作为跨膜蛋白，会和细胞膜紧密结合，纯化过程中需要加入较强的裂解液成分，会破坏跨膜蛋白。

发明内容

基于此，有必要提供一种GPRC5D蛋白的制备方法和应用，能够通过体外无细胞表达系统制备获得具有完整构象的GPRC5D全长蛋白，便于进行靶点研究。

本发明的技术方案如下：

本发明提供一种可采用无细胞表达体系表达GPRC5D蛋白的基因，其序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明提供一种含可采用无细胞表达体系表达GPRC5D蛋白的基因的重组质粒。

本发明还提供一种含可采用无细胞表达体系表达GPRC5D蛋白的基因的重组质粒的构建方法，包括如下步骤：

按照如SEQ ID NO.2所示的序列进行基因合成，并以该合成基因为模板，经PCR反应，获得目的片段；

将质粒载体进行双酶切，形成双酶切产物；