[发明专利]一种重组转氨酶和所述重组转氨酶的突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种重组转氨酶和所述重组转氨酶的突变体及其应用。本发明通过对转氨酶编码基因的密码子进行优化，得到了一种核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的转氨酶编码基因。在此基础上，通过构建转氨酶的突变体库得到了一系列所述转氨酶突变体，并筛选出最优突变体。本发明所获得的重组转氨酶催化剂能够不对称催化合成17种高附加值的手性氨基醇及手性胺，反应转化率最高可达99％，产物光学纯度可达99％以上。且通过蛋白质工程改造获取的转氨酶突变体相比野生型母本活力提高明显，最优突变体相比野生型母本的活力提升105倍，且产物ee在99％以上。

技术领域

本发明涉及酶工程和基因工程领域，具体涉及一种重组转氨酶和所述重组转氨酶的突变体及其应用。

背景技术

手性氨基醇是一类由α-氨基酸经过手性源还原得到的具有光学活性的氨基醇，其作为一类重要的生物活性分子，被广泛地应用于制药、精细化工、材料和不对称催化有机合成等领域。以手性氨基醇为砌块可以合成多种手性药物，包括抗癌药、抗艾滋病药及心血管药物，在手性医药合成领域具有非常重要的作用(Erlanson,D.A.et al.,《Bioorg.Med.Chem.Lett.》，2011(21),3078-3083.Ekegren,J.K.et al.,《J.Med.Chem.》，2006(49),1828-1832)。鉴于手性氨基醇在药物分子合成中的巨大价值，其合成技术的研发已成为新药开发领域的研究热点。

在手性氨基醇的合成步骤中，手性氨基的引入最为关键。目前该类化合物的合成方法包括化学合成法和生物催化法。其中传统的化学合成法以手性试剂的拆分和手性原料的从头合成为主，最高收率为60％～70％，但化学合成法的合成步骤繁琐，条件苛刻，不够绿色、安全，对环境污染较为严重(US20110275855A1；Achmatowicz,M.et al.,《Tetrahedron》,2005,61(38):9031-9041)。生物催化法是利用细胞或酶蛋白为催化剂，以廉价的化合物为出发底物合成目标产物，具有步骤简单、操作安全、选择性高、绿色环保等优点。如借助胺脱氢酶(AmDHs)在辅酶参与下可实现手性氨基醇的不对称合成，但是天然来源的胺脱氢酶源较少，且催化活性普遍偏低，还无法满足工业化应用指标(Wang,H.et al.,《Catal.Sci.Technol.》，2020)。

转氨酶(transaminase,简称TA)，又称氨基转移酶，是一类磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,PLP)依赖性的转移酶，在氨基供体存在下可以特异性将氨基转移到底物酮上，得到相应的手性胺(Mathew,S.et al.,《ACS Catal.》，2012,2(6)，993-1001)。转氨反应过程中无需添加辅酶和金属离子，反应简单易操作，作为一种绿色催化剂，转氨酶来源广泛，广泛存在于动物、植物和微生物中。早在2010年Merck和Codexis公司利用酶工程改造技术，创制了能够高效转化大位阻底物西他列汀酮的ω-转氨酶，实现了糖尿病治疗药物西他列汀的工业化制备的先例(Savile,C.K.et al.,《Science》，2010(329)，305-309)，因此转氨酶在未来手性胺的合成中更具有应用前景。

目前利用转氨酶催化合成手性氨基醇的研究报道较少，已报到的转氨酶仅包括AsTA,BM-xTA,MvTA(CN104131048A；CN108823179A；Zhang J.D.et al.,《J.Biotechnol.》，2019(290),24-32；C.S.Fuchs et al.,《Bioorg.Med.Chem.》，2014((22),5558–5562)，且此类转氨酶的底物催化范围较窄，催化活力偏低。如来源于放线菌(Actinobacteria sp.)的转氨酶可催化4-羟基-2-丁酮生成(R)-3-氨基丁醇，湿细胞的催化活力仅为596U/g，因此还无法应用于大规模的工业化生产。