[发明专利]植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法

说明书

本发明公开了植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，包括如下步骤，步骤1：设计引物构建原核表达载体；步骤2：原核系统中蛋白的表达；步骤3：蛋白纯化。本发明在传统原核表达纯化的基础上，根据膜结合蛋白的蛋白结构与性质，优化了其纯化方法，并筛选了相应的诱导表达条件与纯化缓冲液配置方法，实现了对膜结合蛋白的原核高浓度纯化表达。

技术领域

本发明涉及一种表达纯化的方法，特别涉及一种植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法。

背景技术

拟南芥(Arabidopsis thaliana)又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草。属被子植物门，双子叶植物纲，十字花科植物，拟南芥基因组大约为12500万碱基对和5对染色体。拟南芥是一年生细弱草本，高20-35厘米，被单毛与分枝毛。花序为疏松的总状花序，结果时可伸长达20厘米；萼片长圆卵形，长约1.5毫米，顶端钝、外轮的基部成囊状，外面无毛或有少数单毛；花瓣白色，长圆条形，长2-3毫米，先端钝圆，基部线形。角果长10-14毫米，宽不到1毫米，果瓣两端钝或钝圆，有1中脉与稀疏的网状脉，多为桔黄色或淡紫色；果梗伸展，长3-6毫米。种子每室1行，种子卵形、小、红褐色。花期4-6月。由于这些优点，拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。

膜结合转录因子(membrane-bound transcription factors，MTFs)是转录因子家族中一类特殊的转录因子，在正常生长条件下通常锚定在细胞质膜或者内膜上并以静息状态存在。当植物体处于逆境条件或处在特殊发育阶段时，这些转录因子由内部或外部刺激激活从膜上分离，并迁移进入细胞核到真核生物基因的DNA启动子元件附近，与基因的启动子区域结合并同其他顺式作用元件如增强子、沉默子一起对转录进行调控，并在启动子区域招募RNA 聚合酶，组装成转录起始复合物，从而实现对RNA合成过程的调控(Allen andTaatjes,2015)。使得植物体可以在短时间内对胞内和胞外的多种信号实现快速的生理响应。

蛋白原核表达纯化是通过大肠杆菌在体外表达重组蛋白，目前以成为应用最为成熟的外源蛋白生产方式(Lee and Li et al.,2011)。但外源基因在大肠杆菌中的表达效率通常受到诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度、初始菌液浓度等因素的影响(Busuttil andTurney et al.,2001)。膜结合转录因子，作为细胞内不可缺少的调控因子，在植物的生长发育与胁迫响应的生理过程中发挥着重要的作用，因此其外源表达系统的方法优化，有助于快速高效开展膜结合转录因子的体外生化研究，从而揭示此类转录调控因子的作用机制。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，本发明在传统原核表达纯化的基础上，根据膜结合蛋白的蛋白结构与性质，优化了其纯化方法，并筛选了相应的诱导表达条件与纯化缓冲液配置方法，实现了对膜结合蛋白的原核高浓度纯化表达，可以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，包括如下步骤：

步骤1：设计引物构建原核表达载体

1)设计包含相应酶切位点的无缝克隆引物，随后扩增目的基因，在微量 PCR离心管中配制10μL PCR反应液，反应体系为：pfu DNAPolymerase 1μL， Buffer(10×)1μL，Mg²⁺1μL，dNTP 1μL，Primer-forward和Primer-reverse 两种扩增引物各0.5μL，cDNA 1μL，余量用双蒸水补齐至10μL；

2)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR 反应，反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s 36个循环，72℃延伸10min，得到PCR产物；