[发明专利]植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法

权利要求书

1.植物膜结合转录因子原核表达纯化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：设计引物构建原核表达载体

1)设计包含相应酶切位点的无缝克隆引物，随后扩增目的基因，在微量PCR离心管中配制10μL PCR反应液，反应体系为：pfu DNAPolymerase 1μL，Buffer(10×)1μL，Mg²⁺1μL，dNTP1μL，Primer-forward和Primer-reverse两种扩增引物各0.5μL，cDNA 1μL，余量用双蒸水补齐至10μL；

2)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性1min，94℃变性1min，55℃退火90s，72℃延伸90s 36个循环，72℃延伸10min，得到PCR产物；

3)利用NEB公司酶切试剂盒中的限制性内切酶对PET 30a原核表达载体进行双酶切：20μL的酶切反应液成分为：浓度为50ng/μL质粒DNA 5～10μL，NEB Buffer(10×)2μL，BSA(100×)0.2μL，酶₁0.5μL，酶₂0.5μL，余量为双蒸水补齐；

4)利用无缝克隆技术将扩增的目的基因连接进入PET 30a原核表达载体中，配置10μL的反应液，反应体系为：目的基因扩增片段XμL，线性化载体YμL，SmeaLess CLoning Mix(2×)5μL，其余为双蒸水补齐，其中线性化载体与目的基因扩增片段的摩尔比应介于1:1-1:3之间；

5)PCR连接反应程序：将配制好的PCR反应液，放于PCR仪内，反应程序为：50℃保温45min，16℃持续30min等待回收；

6)将PET 30a原核表达载体与目的基因的重组质粒通过电转法转入大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株；

7)在终浓度为50ng/mL的卡那霉素LB固体培养基上均匀涂布活化后的菌液，筛选成功转入重组质粒的阳性菌株；

8)选取单菌落，在卡那霉素终浓度为50ng/mL的LB液体培养基中充分活化扩增菌体；

9)利用目的基因的检测引物检测活化菌液是否为阳性菌株，配置10μL的反应液，反应体系为：Taq酶(2×)5μL，Primer-forward-check和Primer-reverse-check两种目的基因检测引物各0.5μL，不同活化菌株的菌液为模板1μL，余量为双蒸水补齐；

步骤2：原核系统中蛋白的表达

1)在500mL卡那霉素终浓度为50ng/mL的LB液体培养基中加入OD₆₀₀在0.8的BL21(DE3)大肠杆菌1-2mL；

2)在37℃180rpm的摇床中，扩增菌体6-8小时，菌体扩增前摇床紫外灭菌20min；

3)检测菌液OD₆₀₀在0.8时，向菌液中加入终浓度为0.3-0.4mM的IPTG。

4)18℃160rpm的摇床中诱导12-14h；

5)离心机4℃8000rpm离心收集菌体；

步骤3：蛋白纯化

1)离心机4℃8000rpm离心收集菌体，重悬于pH：7.4的His标签融合蛋白裂解buffer，所述pH：7.4的His标签融合蛋白裂解buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：25mM)，PMSF(终浓度：1mM)，其余为水，其中PMSF需要在使用前加入到溶液中，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；

2)将细菌悬浮液置于冰上，超声破碎细菌获得破碎的细菌悬浮液，超声波粉碎仪的参数设置为：在28℃60％的超声强度下，超声粉碎菌体10min，该过程分别由5s的超声时间和5s的间隔时间循环交替组成；

3)离心机4℃12000rpm离心破碎的细菌悬浮液90min，取上清蛋白溶液于新的离心管中，全程应维持蛋白溶液处在4℃的低温环境下；

4)用10倍体积的ddH₂O清洗gLutathione-sepHarose 4B填料，随后用10倍体积的pH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗填料，所述pH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：25mM)，其余为双蒸水，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；

5)将蛋白溶液与gLutathione-sepHarose 4B填料混匀，放在静音混合器上4℃混合2h；

6)将结合后的混合液预装柱，待上述蛋白液全部流出后，用4℃预冷pH：7.4的His标签融合蛋白重悬buffer清洗柱填料；

7)清洗过程中多次检测杂蛋白的含量，清洗至完全洗去杂蛋白即可；

8)杂蛋白去除干净后封闭柱子，加入4℃预冷的pH：7.4的His标签融合蛋白洗脱buffer与填料多次混匀，静置10min，所述pH：7.4的His标签融合蛋白洗脱buffer溶液的配置方法为：pH：7.4的Tris-HcL(终浓度：20mM)，NaCL(终浓度：500mM)，ImidazoLe(终浓度：250mM)，其余为双蒸水，配置完成的溶液需通过0.45μm的滤菌膜过滤除菌并置于4℃预冷；

9)收集洗脱液，即可用于后续实验和结果分析。