[发明专利]一种抑制地中海富盐菌中目的基因表达的方法

说明书

本发明公开了一种抑制地中海富盐菌中目的基因表达的方法。本发明公开的抑制地中海富盐菌中目的基因表达的方法，包括：1)敲除出发地中海富盐菌中cas3基因，得到cas3敲除菌；2)向cas3敲除菌中导入转录抑制目的基因表达的crRNA的表达盒，得到重组地中海富盐菌，与出发地中海富盐菌相比，重组地中海富盐菌中所述目的基因表达降低。实验证明，本发明的方法可以对地中海富盐菌的基因进行有效的抑制，最低可将目标基因的转录水平抑制到原来的2％，操作流程简单。本发明为地中海富盐菌必需基因的功能研究及合成生物学改造提供了新的工具，推进了地中海富盐菌作为生产高值产品的底盘细胞的研究进程。

技术领域

本发明涉及生物技术领域中，一种抑制地中海富盐菌中目的基因表达的方法。

背景技术

CRISPR-Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR associated proteins)系统是一种广泛存在于细菌和古菌中的获得性免疫系统，是目前在原核生物中发现的唯一一种获得性免疫系统，可以抵御入侵的外源遗传因子(如病毒和质粒等)。该系统包括CRISPR(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats)结构和功能相关的Cas(CRISPR-associated)蛋白两个组分。其中，CRISPR结构由高度保守的短重复序列(repeat)和不同的间隔序列(spacer)组成，该结构前通常有一段前导序列(leader)，其内部含有启动子元件，决定了CRISPR结构的转录方向。PAM序列位于CRISPR-Cas系统靶向的核酸序列上，并紧邻着protospacer。对于I型和V型CRISPR-Cas系统，PAM序列一般位于protospacer的5’端上游；而对于II型CRISPR-Cas系统来说，PAM序列通常在protospacer的3’端下游。

目前，CRISPR-Cas系统被分为class 1和class 2两大类群，其中，class 1包含I型、III型和IV型3个主要类型及16个亚型，class 2包含II型、V型和VI型3个主要类型及17个亚型。在I型CRISPR-Cas系统中，crRNA(CRISPR-derived RNA)结合多个Cas蛋白形成的效应复合物称为Cascade(CRISPR-associated complex for antiviral defense)，其蛋白组分一般包含Cas5、Cas6、Cas7和一些亚型特异的蛋白。

目前，最常用于抑制基因表达的是CRISPR-dCas9系统。对来自于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的两个核酸酶结构域进行突变，产生的dCas9失去核酸切割活性，但仍可特异性地结合DNA。通过设计特异的sgRNA(target-specific guideRNA)，指导dCas9靶向并结合于目标基因的启动子区，可阻止RNA聚合酶与启动子序列的结合，从而抑制转录的起始。若dCas9结合到目标基因的开放阅读框区，则会阻止RNA聚合酶的移动，从而阻止转录的延伸。基于以上原理，CRISPR-Cas系统被开发成用于抑制基因表达的工具，即CRISPRi。

地中海富盐菌(Haloferax mediterranei)是嗜盐古菌生理代谢研究的模式菌株，同时也是极具潜力的PHBV(聚羟基丁酸羟基戊酸酯)工业生产菌株之一，具有I-B型CRISPR-Cas系统。现有的CRISPRi技术无法直接应用于地中海富盐菌，因为地中海富盐菌胞内的高盐环境，无法表达有活性的dCas9，难以利用dCas9构建CRISPRi系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何抑制地中海富盐菌中目的基因表达。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种抑制地中海富盐菌中目的基因表达的方法，所述方法包括：

1)敲除出发地中海富盐菌中cas3基因，得到cas3敲除菌；