[发明专利]一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒

权利要求书

1.一种基于核酸滚环扩增反应的同时检测多种生物标志物的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由4个独立包装的组分组成；

组分1包括标记单链脱氧核糖核酸的特异性抗体溶液，每个所述生物标志物标记不同的单链脱氧核糖核酸；

组分2包括包被所述生物标志物的特异性抗体的磁珠悬浊液；组分1中的特异性抗体与组分2中的特异性抗体不同，但互为配对，且能够实现对所述生物标志物的双抗夹心反应；

组分3包括含有不同环状脱氧核糖核酸的反应液，所述环状脱氧核糖核酸分别与组分1中的对应的单链脱氧核糖核酸部分互补；

组分4包括含有不同探针的反应液，所述探针中包括一个荧光基团、一个脱嘌呤/脱嘧啶和一个淬灭基团；

所述生物标志物为检测心血管疾病的生物标志物，包括心肌肌钙蛋白I cTnI、肌红蛋白Myo和肌酸激酶同工酶CKMB；

所述组分1的特异性抗体溶液中包括ssDNA1-cTnI Ab1、ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1；所述ssDNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，ssDNA2的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，ssDNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

组分2的磁珠悬浊液中包括Mb-cTnI Ab2、Mb-Myo Ab2和Mb-CKMB Ab2；

组分3的反应液中包括Circular DNA1、Circular DNA2、Circular DNA3、DNA聚合酶、dNTP、MgAC₂、DTT和Tris buffer；所述Circular DNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，Circular DNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，Circular DNA3的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；

组分4的反应液中包括cTnI-FAM-AP-BHQ2、Myo-Cy3-AP-BHQ2、CKMB-Cy5-AP-BHQ2、Endonuclease IV和buffer；所述cTnI-FAM-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述Myo-Cy3-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，所述CKMB-Cy5-AP-BHQ2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。

2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-Myo Ab1和ssDNA3-CKMB Ab1的制备方法，包括：(1)分别合成5’端修饰DIBO基团的ssDNA1、ssDNA2和ssDNA3，得DIBO-ssDNA1、DIBO-ssDNA2和DIBO-ssDNA3；

(2)分别对cTnIAb1、Myo Ab1和CKMB Ab1进行重氮化处理，使抗体Fc片段上的糖链被修饰生成重氮基团，得N3-cTnIAb1、N3-Myo Ab1和N3-CKMB Ab1；

(3)分别将所述DIBO-ssDNA1、DIBO-ssDNA2和DIBO-ssDNA3与N3-cTnI Ab1、N3-Myo Ab1和N3-CKMB Ab1进行偶联反应，得所述ssDNA1-cTnIAb1、ssDNA2-MyoAb1和ssDNA3-CKMBAb1；

步骤(1)和步骤(2)不存在时间上的先后关系。