[发明专利]一种双靶向磁性荧光纳米微球、其制备方法及在肝癌循环肿瘤细胞中的应用

说明书

本发明公开了一种双靶向磁性荧光纳米微球、其制备方法及在肝癌循环肿瘤细胞中的应用。此纳米微球以羧基修饰的磁性四氧化三铁微球作为基质，通过在磁性四氧化三铁表面同时引入抗上皮细胞粘附分子和与氨基肽酶具有强亲和力的荧光探针，获得双靶向磁性‑荧光纳米微球。该双靶向纳米微球在没有破坏细胞活性(＞90％)的基础上大大提高了对肝癌循环肿瘤细胞的捕获效率(＞90％)和捕获纯度(＞90％)。更为重要的是，纳米粒子具有的精准双靶向性能，高分辨率荧光成像以及优异的选择性使本申请的纳米平台成为了第一例实现对体内循环肿瘤细胞的实时识别成像和监控。

技术领域

本发明属于生物材料传感技术领域，特别涉及一种双靶向磁性荧光纳米微球、其制备方法及在肝癌循环肿瘤细胞中的应用。

背景技术

肝癌是一种恶性和异质性疾病，每年导致近100万例与肝癌相关的死亡。高复发率(肝切除术后5年内几乎70％)和远处转移是肝癌成为第二大癌症相关死亡的主要原因。传统的肝癌循环肿瘤细胞的影像学诊断和分期评估具有检测局限性，导致了对疾病真实程度的低估。因此，在复杂的肝癌生物学研究中，寻找有效的，具有代表性的生物标志物对肝癌的早期诊断、复发预测和预后评估是迫切需要的。转移性扩散源于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)，这些细胞通过血液途径从原发肿瘤中脱落，在远处组织处继续生长。

从外周血中检测CTCs可以预测原发性肿瘤的信息、评估疾病进展以及跟踪各种癌症的预后。此外，作为“液体活检”最有前景的靶点，CTCs的计数为临床癌症的诊断和个性化治疗提供了可靠的依据。因此，CTCs作为肝癌循环肿瘤细胞(Hepatocellular carcinomacirculating tumor cells,HCC)的有效生物标志物已被广泛研究。

目前，基于上皮细胞粘附因子(Epithelial cell adhesion,EpCAM)的修饰磁珠检测HCC-CTCs是食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的。然而，考虑到HCC-CTCs在血流中的高复发率和极少量的数目，使用EpCAM作为分离CTCs的单一靶点，其检测率仅在30％到80％之间。单纯基于EpCAM的分离技术主要存在以下缺点：(1)体外模拟的CTCs实验结果与体内实验结果不一致，或者由于CTCs的高度异质性和表型的改变，导致出现漏捕和假阴性信号；(2)由于良性上皮细胞因炎症或其他肝病释放到血液循环中而导致的假阳性结果。因此，并非所有的肝癌循环上皮细胞都是肿瘤细胞；(3)其他血液细胞(白细胞、红细胞等)产生的信号干扰无法避免。

氨基肽酶(Aminopeptidase N,APN)作为一种锌依赖性金属蛋白酶，位于细胞外膜，在信号肽(脑啡肽)的下调、转移性肿瘤细胞侵袭或肿瘤血管生成促进和肿瘤细胞存活中起着重要的作用。APN酶在多种肿瘤细胞中呈现高表达，如肝细胞癌、前列腺癌、卵巢癌和肾细胞癌，这表明APN酶可以作为肿瘤影像学标志物和治疗靶点。APN酶与肿瘤肽序列天冬酰胺-甘氨酸-精氨酸(NGR)具有很高的亲和力。因此，通过将APN酶作为受体合成了各种基于NGR结构的荧光探针。与复杂的NGR肽结构相比，具有高生物利用度、选择性、分辨率、无创性和体内稳定性等优点的小分子荧光显像剂受到了前所未有的关注。

除此之外，现有的大多数技术主要集中在对CTCs的体外检测。这些研究的缺点包括：(1)预处理时间长，检测效率低；(2)提取过程中，CTCs的形态发生变化；(3)难以做到长时间的实时动态监测。因此，对生物体血管内流动的CTCs进行动态成像和监测的技术需求也是亟待解决的。

发明内容

针对现有技术中的不足之处，本发明通过在磁性四氧化三铁表面同时引入抗上皮细胞粘附分子和与氨基肽酶具有强亲和力的荧光探针，获得了一种用于肝癌循环肿瘤细胞体内捕获和识别的双靶向磁性-荧光纳米微球。该双靶向纳米微球在没有破坏HCC-CTCs活性(＞90％)的基础上,大大提高了对HCC-CTCs的捕获效率(＞90％)，与MB-COOH,MB-MLP和MB-EpCAM组相比，在捕获效率方面分别提高了60.1％，35.5％和25.5％。