[发明专利]一种表征心肌细胞胞质分裂的动物模型构建方法及应用在审

专利信息
申请号: 202011272031.4 申请日: 2020-11-13
公开(公告)号: CN112375787A 公开(公告)日: 2021-02-19
发明(设计)人: 付文斌;王伟;曾春雨 申请(专利权)人: 中国人民解放军陆军特色医学中心
主分类号: C12N15/90 分类号: C12N15/90;C12N15/873;A01K67/027;A61K49/00
代理公司: 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 代理人: 赵荣之
地址: 400042 重*** 国省代码: 重庆;50
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摘要:
搜索关键词: 一种 表征 心肌 细胞 分裂 动物 模型 构建 方法 应用
【说明书】:

发明涉及一种表征心肌细胞胞质分裂的动物模型构建方法及应用,属于医学动物模型研究领域,所述构建方法具体为,通过同源重组技术,构建心肌细胞Aurkb基因与荧光标记基因非融合表达的胚胎干细胞,将胚胎干细胞注入动物囊胚中,经培育杂交后筛选出荧光标记Aurkb基因的动物模型,所述非融合表达具体为荧光标记基因在Aurkb基因转录启动子中,并随Aurkb基因的转录而转录。本发明首次利用Aurkb这一胞质分裂的特异性基因,建立非融合荧光蛋白报告动物模型,所构建的动物模型可以标记心肌细胞从开始分裂到完成分裂的全过程,可广泛应用于心肌再生与修复的机制研究以及心肌细胞增殖相关靶向药物的筛选。

技术领域

本发明属于医药研究领域,具体涉及一种表征心肌细胞胞质分裂的动物模型构建方法及应用。

背景技术

心肌梗死(Myocardial infarction,MI)发病率和病死率均很高,严重影响人类健康。MI后的急性缺血导致大量心肌细胞迅速丧失,是MI最终导致心力衰竭和临床死亡的重要病理基础。目前对于MI的治疗方法如溶栓、经皮冠脉介入术或冠脉旁路搭桥术可使闭塞血管再通,药物治疗可缓解心肌重构,但却不能从根本上修复已死亡的心肌组织。心肌再生是治疗MI等疾病的未来方向,也是近年来的前沿研究领域。近年来利用谱系示踪技术证明,这些内源性心肌再生的主要来源是原有心肌细胞的增殖分裂。心肌细胞增殖完整的过程包括DNA复制、胞核分裂和胞质分裂等阶段。然而在心肌梗死等因素刺激下,部分成年心肌细胞虽可以进入细胞周期但难以通过胞质分裂阶段。因此胞质分裂障碍是成年心肌细胞难以增殖的关键环节,目前,有研究通过活细胞工作站直观的观察到了成年心肌细胞胞质分裂的全过程,定义了去分化-增殖-再分化的再生途径,然而目前仍然缺乏评价胞质分裂的在体动物模型。

传统心肌细胞增殖评价指标主要包括Ki67、Brdu/Edu、PHH3和Aurkb,各指标检测结果分别对应不同的细胞周期阶段,如图1所示。Ki67是一种由MKi67基因编码的蛋白质,该蛋白与细胞的增殖密切相关,在有丝分裂期以及分裂间期的细胞(G1、S、G2、M期)中都能检测出Ki-67蛋白,有丝分裂停止的细胞(G0期)中则无Ki67蛋白质存在。而EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物,能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在合成的DNA分子中,基于荧光染料与EdU的特异性反应,即可直接并准确地检测出DNA复制活性。PH3为组蛋白H3在有丝分裂过程中,两个丝氨酸残基Ser10和Ser28发生的磷酸化作用,Ser10磷酸化组蛋白H3首先出现在G2晚期的核周缘,Ser28磷酸化组蛋白H3紧随其后出现,两个位点的磷酸化在有丝分裂中期到达高峰,并扩展到染色体的所有部分,当细胞有丝分裂进入后期和末期,组蛋白H3Ser10和Ser28的磷酸化逐渐消退。Aurkb为调控有丝分裂过程中染色体分离的磷酸化激酶,其与特殊微管k纤维结合控制染色体的运动和分离,并于分裂末期聚集于赤道板区域,控制微丝的紧缩使细胞在此区域产生缢束,缢束逐渐加深使细胞体最后一分为二。

然而心肌细胞增殖评价方法仍然存在的巨大的问题。心肌细胞与其他细胞特殊之处在于:心肌细胞经历DNA复制和核分裂过程,却没有胞质分裂,这种不完全的细胞分裂最终形成双核或多核心肌细胞。心肌细胞这种不完全分裂双核或是多核状态并不是真正意义上的增殖再生过程,实际上这种不完全分裂并没有增加心肌细胞数量,不能称之为细胞增殖。既往传统的心肌细胞增殖检测方法主要是针对细胞DNA复制和核分裂的标记物如,Ki67、Brdu/Edu、PHH3等等,可见这些方法不能真正准确评价心肌细胞增殖的情况,只能代表心肌细胞发生了DNA复制或是细胞核发生了分裂。

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