[发明专利]一种烟酰胺单核苷酸的制备方法

说明书

本发明公开了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，向缓冲液中加入烟酰胺、三磷酸腺苷、尿苷和含有Mg²⁺的化合物，调节pH为6.0～8.0，再加入嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶及烟酰胺核糖激酶制得的粗酶液，进行酶促反应，即得。本发明首次使用尿苷作为底物，且对底物烟酰胺以及ATP、尿苷的转化率达到90％以上。

技术领域

本发明属于产烟酰胺单核苷酸制备领域，具体涉及一种烟酰胺单核苷酸的制备方法。

背景技术

烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide缩写NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，它在被烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成细胞赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称辅酶I)，并且同时直接参与体内腺苷转移，其在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度，在生物细胞能量生成扮演着重要角色，并且对人体无危害。

截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健作用，更多的用途还在不断研发出来，随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求与日俱增。

目前，NMN的制备方法主要包括以下三种：1)酵母发酵法；2)化学合成法；3)生物催化法。其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点；而酵母菌发酵法生产的NMN含一定的有机溶剂残留；生物催化法因不含有机溶剂的残留，也不存在手性问题且制备的NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的NMN制备方法，现有的制备NMN的生物催化法一般是以烟酰胺和5’磷酸核糖基-1’-焦磷酸(PRPP)或AMP或核糖为底物催化下制备NMN，其中PRPP市场价格昂贵且来源受限，导致该生物催化法成本较高，严重制约了其应用和发展。与现有的生产NMN方法的底物而言，尿苷最为经济，且尚未见有采用尿苷为底物生产NMN的报道。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，该方法催化合成周期短，成本低。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，向缓冲液中加入烟酰胺、三磷酸腺苷(ATP)、尿苷和含有Mg²⁺的化合物，调节pH为6.0～8.0，再加入嘌呤核苷磷酸化酶、嘧啶核苷磷酸化酶及烟酰胺核糖激酶制得的粗酶液，进行酶促反应，即得；优选地，所述的含有Mg²⁺的化合物为MgCl₂。

其中，所述的缓冲液的pH为6～8。

其中，所述的尿苷、烟酰胺和三磷酸腺苷的摩尔比为1-3:1-3:1-5，在不添加ATP再生酶的情况下优选为1：1：1。

其中，酶促反应的体系中烟酰胺的终浓度为5～50mM，三磷酸腺苷的终浓度为5～50mM，尿苷的终浓度为5～50mM，含有Mg²⁺的化合物的终浓度为5～25mM。

其中，所述的粗酶液的制备方法为将三种酶构建至所需的载体上，构建好的重组菌株在合适的条件下进行诱导表达、将表达好的重组菌收集破碎，收集上清液即粗酶液并测蛋白浓度。

具体的，包括如下步骤：

(1)分别复制嘌呤核苷磷酸化酶基因、嘧啶核苷磷酸化酶基因和烟酰胺核糖激酶基因，并分别构建于表达载体pET28a中，再转化大肠杆菌Trans1-T1，得到重组质粒；再分别将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，分别得到重组菌BL21(DE3)-pET28a-E2、重组菌BL21(DE3)-pET28a-E3和重组菌BL21(DE3)-pET28a-Nadr；