[发明专利]一种烟酰胺单核苷酸的制备方法

权利要求书

1.一种烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，为以下方式中的任意一种：

方式一：在15.5 mL 50 mM Tris-Hcl缓冲液加入浓度为10 mM 尿苷、10 mM 烟酰胺、2.5 mM 的三磷酸腺苷、5 mM MgCl₂，搅拌均匀调至pH 8.0、加入粗酶液4.5 mL，粗酶液按初始浓度计算加入的体积，体系中添加ATP再生酶Ppk、Adk各500 U/L、10 mM 多聚磷酸钠，37℃条件下反应4 h；

方式二：在15.5 mL 50 mM Tris-Hcl缓冲液加入浓度为10 mM 尿苷、10 mM 烟酰胺、2.5 mM 的三磷酸腺苷、5 mM MgCl₂，搅拌均匀调至pH 8.0、加入粗酶液4.5 mL，三种粗酶液按初始浓度计算加入的体积，体系中添加ATP再生酶Ppk、Pap、Adk各500 U/L、10 mM 多聚磷酸钠，37℃条件下反应4 h；

其中，所述的粗酶液的制备方法包括如下步骤：

（1）分别复制嘌呤核苷磷酸化酶基因、嘧啶核苷磷酸化酶基因和烟酰胺核糖激酶基因，并分别构建于表达载体pET28a中，再转化大肠杆菌Trans1-T1，得到重组质粒；再分别将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）中，分别得到重组菌BL21(DE3)-pET28a-E2、重组菌BL21(DE3)-pET28a-E3和重组菌BL21(DE3)-pET28a-Nadr；

（2）将步骤（1）得到的三种重组菌的菌液均接种于LB/KanR液体培养基中，培养至OD₆₀₀为0.5~0.7，加入IPTG，培养，离心，收集菌体；其中，所述的LB/KanR液体培养基中各组分的浓度为：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化钠5 g/L，溶剂为水；

（3）将步骤（2）得到的菌体重悬于pH6.0- 8.0 的缓冲液中，破碎，离心，所得上清液即为粗酶液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，加入IPTG 至终浓度0.025mM~1 mM。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的培养为在15~37℃、100-200 rpm条件下振荡培养12~24 h。