[发明专利]一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用

说明书

本发明公开一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。本发明在大肠杆菌中过表达天冬氨酸氨基甲酰基转移酶催化亚基PyrB、二氢乳清酸脱氢酶PyrD、Orotidine‑5'‑磷酸脱羧酶蛋白PyrF成功构建了一类可广泛应用于制备食品、药品、饲料以及化学品的抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌；相较于对照菌株，本发明提供的重组菌株对衣康酸、D‑乳酸、琥珀酸的胁迫抗性均得到了显著提高。本发明的操作简单，可广泛的应用到工业生产中。

技术领域

本发明涉及一种抗酸胁迫能力提高的大肠杆菌工程菌及其应用，属于微生物工程技术领域。

背景技术

大肠杆菌是原核生物中一种重要的宿主菌。这类细菌在自然界分布极为广泛，具有丰富的物种多样性。它们不仅是研究生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。目前，已有多种高价值的有机酸生物发酵方法成功应用，其中也有人尝试以大肠杆菌为宿主来表达，但是常常存在酸胁迫的问题。

高光学纯度D-乳酸(97％以上)作为一个手性中心是多种手性物质的前体，是重要的手性中间体与有机合成原料，广泛应用于制药、高效低毒农药及除草剂、化妆品等领域的手性合成，并且D-乳酸也是生物塑料聚乳酸的原料。目前发酵法制备乳酸以其绿色、高效、环保，在工业上具有广泛的应用前景，虽然在大肠杆菌中有固有的乳酸生成途径，可通过乳酸脱氢酶(LdhA)将丙酮酸转化为乳酸，不需要额外引入异源LdhA来产生乳酸，但是由于大肠杆菌系统存在酸胁迫的问题，而制约着乳酸的产量的提高。

琥珀酸作为具有巨大潜力的前提物质，可以用来生产四氢呋喃等各种衍生物，在2010年被评估为“该化合物或技术已在文献中引起极大关注，具有强大的平台潜力、产品或技术的规模正在逐步扩大，以进行试点，演示或全面推广”，琥珀酸及其直接衍生物的市场潜力预计每年高达245×103吨，而琥珀酸衍生的聚合物的市场规模估计高达每年25×106吨。在传统的工程菌株发酵工艺中，琥珀酸是由曼海姆氏琥珀酸杆菌Mannheimiasucciniciproducens等发酵生产，产量约为68.41g·L^-1。这类菌株是自然存在的可以代谢产生琥珀酸，也已具有较高的产量，但是这类菌株的一个共性问题是他们的代谢改造相对来说较为复杂和困难，通常来说营养缺陷型的菌株在发酵时需要更多的营养添加物质，造成了无法实现大规模的工业应用，所以研究者们又将目光瞄准了大肠杆菌。

衣康酸学名为甲叉琥珀酸、亚甲基丁二酸，是不饱和二元有机酸，它含不饱和双键，具有活泼的化学性质，可进行自身间的聚合，也能与其他单体如丙烯腈等聚合，是化学合成工业的重要原料，也是化工生产的重要原料。采用大肠杆菌作为天然宿主时，由于大肠杆菌本身不具备衣康酸代谢能力，起初被报道出来的产量非常低，少于1g·L^-1，后来发展到4.3g·L^-1。直到最近，可见的报道中，衣康酸最高的产量也仅仅为47g·L^-1，其合成途径主要由乌头酸氧化途径产生，从最终的产量上来，仍然与采用曲霉菌属为宿主时的产量有一定差距，其产率为0.86g·h^-1·L^-1，虽然与传统的曲霉类生产菌属相比，在产量上存在一些不足，但以大肠杆菌作为衣康酸的生产宿主依然可以被认为是具有潜力的。

但是大肠杆菌本身存在对有机酸耐受性不高的限制发展因素，大肠杆菌适应生长环境为中性，可乳酸生产环境的pH值适宜在pH 5.5以上，但约50g·L^-1的有机酸即会使环境pH降低至pH 2.0左右，这对大肠杆菌的生长是一种考验。

对于酸胁迫，为维持大肠杆菌发酵生产目的蛋白的稳定性并提高生产效率，过去，工业上常常通过在大肠杆菌发酵的过程中添加外源中和剂来维持pH处于稳定的范围，例如，通过添加碱性物质(碳酸钙)来控制发酵环境的pH值。然而，碱性物质的添加往往会导致副产物的积累，而副产物中形成的盐类会再次导致细胞处于高渗的环境，从而造成渗透压胁迫的产生，再次影响菌体的生长与代谢。