[发明专利]一种融合基因及其应用

说明书

一种融合基因及其应用，由翻译埃博拉GP蛋白基因的C端与SEQ ID NO.1所示的序列融合组成；本发明将截短的埃博拉膜蛋白GP基因与外源序列融合，构建重组杆状病毒，病毒感染昆虫细胞后，在感染的细胞中可以高效的表达EBOV‑GP蛋白，并且纯化的杆状病毒BV囊膜上EBOV‑GP蛋白的量也显著增加，其表达量较对照可增加40%‑68%。本发明公布的应用方法，对难以表达的埃博拉膜蛋白GP有明显的改进效果。

技术领域

本发明属于杆状病毒表达系统及蛋白表达领域，具体涉及一种融合基因及其在提高埃博拉膜蛋白GP表达量中的应用。

背景技术

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的埃博拉出血热疾病在1976年爆发，当时在刚果民主共和国与苏丹共造成431人死亡。在人类和非人灵长类动物中，EBOV常常引起致命的出血热，致死率在50％-90％。传统灭菌疫苗效果不佳，相关疫苗主要是通过重组病毒来构建，如病毒样颗粒疫苗、核酸疫苗及活载体疫苗。

埃博拉病毒属于单股反义病毒目(Mononegavirales)丝状病毒科(Filoviridae)埃博拉病毒属(Ebolavirus)。博拉病毒由长度为18.9kb的非节段单股反义RNA组成，分子量为4.17×10⁶，其病毒粒子基因组的复制与转录在内部完成。EBOV基因组包括7个基因和两个调节区域，7个基因分别由各自的mRNA转录，有各自独立的开放阅读框，顺序为3’-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’，分别编码核蛋白(NP)、基质蛋白(VP40)、糖蛋白(GP)、结构蛋白(VP30)、小基质蛋白(VP24)、RNA依赖的RNA聚合酶(L)。

Ebola virus的GP蛋白(EBOV-GP)，是Ebola唯一的表面囊膜蛋白，在包膜表面形成刺突结构，与细胞表面受体结合，介导病毒入侵，因此是疫苗研究的靶蛋白。EBOV-GP蛋白为糖基化的膜蛋白，因此其表达比较困难。

在大肠杆菌中表达的GP蛋白常以包涵体形式存在；在哺乳动物细胞中表达，针对其表达量及抗原性要求比较高。目前疫苗青睐于表达GP突变蛋白的腺病毒及水泡性口炎病毒重组RNA疫苗。腺病毒载体疫苗的缺陷主要是人群中普遍存在预存免疫现象。而水泡性口炎病毒载体作为一种活病毒载体，其具有潜在的生物安全风险。此外埃博拉病毒样颗粒疫苗可以实现对非人灵长类动物的完全保护，但是无法大量生产。

杆状病毒表达系统表达的外源蛋白能对蛋白进行有效的修饰，比如可以使表达的外源蛋白有很好的糖基化、磷酸化等修饰；杆状病毒宿主域窄，对人畜安全，更适宜于表达生物医药有关的外源蛋白；杆状病毒的出芽型病毒(Budded virus，BV)病毒粒子结构相对简单，尤其是BV囊膜的组分仅有二十余种蛋白组成，如果表达的外源蛋白能组装到BV，甚至组装到BV的囊膜上，通过超速离心收集BV，进一步裂解BV，收集BV囊膜，这样可以获得含有很少宿主蛋白的目的外源蛋白，方便进一步获得高纯度的目的蛋白，用于疫苗等的制备。

鉴于以上理由，本发明公开一种融合基因在提高埃博拉膜蛋白GP表达量中的应用。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供一种融合基因及其应用，该应用将截短的EBOV-GP基因的C端与SEQ ID NO.1序列融合，整合到杆状病毒基因组上，产生的重组病毒，在感染昆虫细胞后能显著提高GP蛋白的表达量。

技术方案：一种融合基因，由翻译埃博拉GP蛋白基因的C端与SEQ ID NO.1所示的序列融合组成。

上述融合基因在提高埃博拉膜蛋白GP表达量中的应用。

上述应用，将所述融合基因整合到杆状病毒表达载体中，转染、感染昆虫细胞。

上述融合基因在提高病毒囊膜中埃博拉GP蛋白表达量中的应用。

上述应用，将所述融合基因经克隆获得重组质粒，通过转座获得重组bacmid，转染、感染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。