[发明专利]一种PRRSV的IPMA抗体检测方法

说明书

本发明公开了一种PRRSV的IPMA抗体检测方法，属于分子生物学检测技术领域。本发明公开的一种PRRSV的IPMA抗体检测方法，包括接毒、铺板、固定、加一抗、加二抗、显色。本发明PRRSV的IPMA抗体检测方法，细胞反应板可提前制备，可在‑20℃长期保存；反应结果可用显微镜进行观察；具有特异性强、敏感性高、操作简单、可长期保存的特点。IPMA方法利用活病毒接种，使用的是全病毒，抗原结构更加完整，结果更具有准确性和代表性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种PRRSV的IPMA抗体检测方法。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的一种高接触性呼吸道传染疾病，传播速度快，传播途径广，发病率高，死亡率高，严重危害养猪业的发展。

PRRSV是一种正链包膜RNA病毒。PRRSV感染的抗体反应非常复杂，并且仍不是很清楚。然而，已经建立了多种方法来检测PRRSV特异性抗体作为PRRSV感染的血清学标志物，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)以及基于免疫荧光和免疫层析带的测定。PRRSV特异性中和抗体(NAb)通常在接种后(dpi)28天后出现，但在感染后第一周内产生的非保护性抗体可能对PRRSV感染的早期检测更为有用。这些早期抗体包括对PRRSV N蛋白或nsps等结构蛋白具有特异性的非中和抗体，N蛋白和某些非结构蛋白(nsp1，nsp2和nsp7)已被证明具有高度免疫原性。

目前检测PRRSV特异性抗体的大多数商用ELISA试剂盒(例如IDEXX Herd ChekPRRS ELISA)都采用抗N抗体作为PRRSV感染或改良活病毒(MLV)免疫状态的血清学标志物。尽管诸如ELISA之类的商业测试对于确定血清样品中PRRSV特异性抗体的存在非常敏感，但是ELISA不适合用于抗体水平的定量分析。该缺点是由于以下事实：从ELISA获得的OD值通常在窄范围(0.1至2)内变化。此外，大多数ELISA试剂盒使用原核表达的单个重组PRRSV结构抗原(通常为PRRSV-N蛋白)作为包被抗原。因此，此类系统无法评估针对其他PRRSV包膜蛋白或非结构蛋白(nsps)的PRRSV特异性抗体反应。在此应注意，由于表达和纯化多种ELISA板包被抗原需要付出巨大的努力，因此可能不会开发使用多种PRRSV抗原的系统。此外，由于ELISA包膜抗原在大肠杆菌中表达的一般性质，经常报告假阳性或假阴性结果。基于此，迫切需要开发一种用于准确检测PRRSV特异性抗体的改进方法。

因此，提供一种PRRSV的IPMA抗体检测方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种PRRSV的IPMA(免疫过氧化物酶细胞单层试验)抗体检测方法，用于特异性检测PRRSV抗体。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种PRRSV的IPMA抗体检测方法，具体步骤如下：

(1)接毒：细胞瓶内细胞长至50-70％时，将100个TCID₅₀的PRRSV病毒液接种到Marc145细胞上，加入含2％胎牛血清的DMEM培养基进行培养；

(2)铺板：细胞长满后将其铺到96孔板内，每孔接种100μL，置于CO₂培养箱中继续培养24h，观察细胞生长情况，待细胞长满后，取出96孔板；同时设立不接毒正常细胞对照孔；

(3)固定：把取出的96孔板用PBS冲洗2-3次，然后用预冷的无水乙醇于-20℃固定30min，细胞反应板制备成功；

(4)加一抗：把细胞反应板用PBS洗过2-3次，加入100μL用0.01M PBS1:400稀释的PRRSV标准阳性血清，置于37℃中作用1h；