[发明专利]一种基于斑马鱼炎症性肠病模型筛选药效物质的方法

说明书

本发明公开了一种基于斑马鱼炎症性肠病模型筛选药效物质的方法，属于药物筛选技术领域。所述方法包括：(1)将待测物质加入到含有斑马鱼胚胎的孵育液A中预保护，再换液加入含有三硝基苯磺酸的孵育液B，继续孵育，得到给药模型；(2)利用与活性氧反应的荧光染料对给药模型的斑马鱼胚胎进行处理，荧光成像并分析斑马鱼胚胎肠道区域内的平均荧光强度，与未给药模型组的活性氧水平进行比较，筛选具有统计学差异的物质作为目标物质。本发明成功构建了斑马鱼炎症性肠病模型，利用显微成像技术显示表型变化，将其应用于治疗炎症性肠病药物的筛选，显著提高了筛选效率、缩短了筛选时间。

技术领域

本发明涉及药物筛选与评价技术领域，具体涉及一种基于斑马鱼炎症性肠病模型筛选或评价药效物质的方法。

背景技术

炎症性肠病(IBD)是表现为慢性或复发的免疫反应和炎症症状的胃肠道疾病的总称，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)，目前无法治愈。临床治疗用药主要包括氨基水杨酸类、皮质类固醇类、免疫抑制剂、生物制剂等,但由于炎症性肠病复杂的发病机制和病因学，现有临床药物存在治疗效果不佳及价格昂贵等缺点。

在炎症性肠病的临床治疗中，中药发挥整体调节和综合治疗的优势,具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、免疫调节等多种生物活性及药理作用，能显著改善腹泻、腹痛、便血等肠炎症状，在临床患者的治疗当中起到缓解症状的效果，其多途径、多靶点、整体性的作用特点在炎症性肠病的治疗防治中独具优势。

迄今为止，IBD中最完善的模型是小鼠模型，它作为一种有价值的动物模型，在肠道菌群、免疫反应、感染、遗传等方面对IBD的认识做出了很大的贡献。但是小鼠模型也存在一定的局限性，比如病理变化不能通过连续观察来确定、遗传操作困难、通量小、速度慢等。近几年来，斑马鱼由于其高产卵率和胚胎体外受精发育等优势，在药物筛选领域受到研究者们的青睐，如专利文献CN 108719145 A、CN106755099 A。斑马鱼与人类基因同源性约为80％，且其肠道早期发育与人类肠道发育过程高度相似，可以成为研究炎症性肠病及胃肠疾病的有利工具。

荧光成像技术是利用激发光使得荧光基团达到较高的能量水平,然后发射出较长波长的光这一原理进行检测。目前常用的荧光基团有绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(Ds Red)等。活体荧光成像技术可从整体上展示完整的自然状态下的生物，与其他的活体内成像技术相比，荧光成像技术有着敏感度高、安全易操作、结果直观、数据真实可靠、费用低廉等优点，已被广泛应用于生命科学、医学研究及药物开发等领域。

发明内容

本发明的目的是提供一种斑马鱼炎症性肠病模型，利用该模型结合成像技术和分子生物学技术用于筛选和评价天然产物以及化学合成药物中对炎症性肠病具有治疗作用的物质。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于斑马鱼炎症性肠病模型筛选药效物质的方法，包括以下步骤：

(1)将待测物质加入到含有斑马鱼胚胎的孵育液A中进行预保护，再换液加入含有三硝基苯磺酸的孵育液B，继续孵育，得到给药模型；

(2)利用与活性氧反应的荧光染料对给药模型的斑马鱼胚胎进行处理，荧光成像并分析斑马鱼胚胎肠道区域内的平均荧光强度，与未给药模型组的活性氧水平进行比较，筛选具有统计学差异的物质作为目标物质。

当斑马鱼模型的肠道发生炎症反应，其活性氧(ROS)水平显著上升。利用对炎症性肠病具有治疗作用的物质对斑马鱼胚胎先进行预保护，再造模，相较于未进行预保护的模型组，其活性氧水平呈现下降趋势，因此，本申请通过检测活性氧水平的变化情况来判断待测物质是否对炎症性肠病具有治疗或预防作用，从而筛选出对炎症性肠病具有治疗作用的药效物质。