[发明专利]一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，包括步骤如下：构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系；通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体，其能够中和新冠病毒，对新冠病毒有治疗和预防潜力。因此，上述方法制得的一种表达ACE2蛋白的外泌体能应用于制备抗新型冠状病毒SARS‑CoV‑2药物。

技术领域

本发明属于医疗技术领域，涉及一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用。

背景技术

新型冠状病毒属冠状病毒属(Coronavirus)，其基本结构由M蛋白、S 蛋白、N蛋白、E蛋白以及基因组单链RNA和包膜组成。研究表明，新冠病毒与SARS侵染人体的机制相似，均是由S蛋白与人体细胞的ACE2蛋白相结合，从而介导病毒侵染宿主。

血管紧张素转化酶2(ACE2)是羧肽酶ACE的同源物，生理条件下，ACE将血管紧张素Ⅰ(Ang I)转化为血管紧张素II(Ang II)，从而激活肾素-血管紧张素系统(RAS)，而ACE2作为RAS的负调节因子，通过切割灭活Ang II来负调控RAS的激活，从而调节机体的内环境稳态。

外泌体是一类大多数细胞会分泌的、大小30-150nm、由细胞内特殊机制产生的胞外囊泡。外泌体在被宿主细胞分泌出来后，可以通过血液、组织液传递到不同的靶细胞或者器官，利用其所具备的源自供体细胞的各项特征如功能蛋白、lncRNA、microRNA、生化代谢产物等调节靶细胞的生理状态，参与机体周身的生理状态调节。

目前在新型冠状病毒肺炎防治相关的科研工作中，预防以全球性的多类新冠病毒疫苗研发为主流，而治疗则以基本的临床治疗手段为主，二者之间仍存在一定断层，疫苗研发耗时耗力，短期内难以完成。小分子药物一般研制周期很长，目前都是旧药新用，比如氯奎，药效有限。除小分子药物外，血浆疗法虽好，但有一定风险，因为血浆因人而异，是一个复杂的混合物，而且血浆来源有限，不能大规模使用。而随着全球感染人数的持续增加，医疗投入已不堪重负，此时需要能够高效治疗临床患者、阻止患者病情进一步恶化的新方法新手段被开发出来。

发明内容

本发明目的是提供一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用，来解决上述问题。

本发明的技术方案是：

一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用，包括步骤如下：

(1)构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系；

(2)通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体。

进一步的，步骤(1)中，所述构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系包括如下步骤：

通过聚乙烯亚胺PEI转染体系将pVSV、pGAG、pREV和已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒转入第一细胞培养皿中，在所述第一细胞培养皿中有密度为60％-80％的HEK293T细胞，8～12h后更换新鲜DMEM培养基，在温度为37℃的恒温条件下于CO₂培养箱中培养，培养时间大于48h，在培养期间，病毒包装系统会在HEK293T细胞内组装形成含有ACE2基因组的慢病毒颗粒并被释放到DMEM培养基中；

将病毒悬液即所述DMEM培养基转移到第一离心管中，在室温1500rpm 条件下离心3～5min，获得分层的病毒悬液，吸取所述病毒悬液的上清液，并转移至第二离心管中；

取所述病毒悬液的上清液，加入第二细胞培养皿中，在所述第二细胞培养皿中含有密度为30％的hMSC人骨髓间充质干细胞，按1:1000的比例加入polybrene，进行感染，所述感染的时间大于48h，获得感染病毒的hMSC 人骨髓间充质干细胞；