[发明专利]一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)构建稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系：通过聚乙烯亚胺PEI转染体系将pVSV、pGAG、pREV和已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒转入第一细胞培养皿中，在所述第一细胞培养皿中有密度为60％-80％的HEK293T细胞，8～12h后更换新鲜DMEM培养基，在温度为37℃的恒温条件下于CO₂培养箱中培养，培养时间大于48h，在培养期间，病毒包装系统会在HEK293T细胞内组装形成含有ACE2基因组的慢病毒颗粒并被释放到DMEM培养基中；

将病毒悬液即所述DMEM培养基转移到第一离心管中，在室温1500rpm条件下离心3～5min，获得分层的病毒悬液，吸取所述病毒悬液的上清液，并转移至第二离心管中；

取所述病毒悬液的上清液，加入第二细胞培养皿中，在所述第二细胞培养皿中含有密度为30％的hMSC人骨髓间充质干细胞，按1:1000的比例加入polybrene，进行感染，所述感染的时间大于48h，获得感染病毒的hMSC人骨髓间充质干细胞；

给所述感染病毒的hMSC人骨髓间充质干细胞更换培养基，并按1:1000的比例加入puromycin进行筛选作为培养组，同时取一盘同密度未经任何处理的hMSC人骨髓间充质干细胞更换新鲜的培养基并同样加入puromycin作为对照组；

在所述培养组进行puromycin筛选超过48h且在对照组hMSC人骨髓间充质干细胞完全死亡后，所述培养组存活的细胞即为稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系，其中，所述polybrene的终浓度为5μg/mL，所述puromycin的终浓度为1μg/mL；

(2)通过超速离心法从hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养上清液中提取富含ACE2蛋白的外泌体：取稳定表达人源ACE2蛋白的hMSC人骨髓间充质干细胞系的培养基，离心10min；收集培养基的上清液，离心20min；转移上清液至第一超离管内，离心1h；收集上清液至第二超离管内，离心70min；弃掉85％的上清液，管内剩余的培养基用无菌PBS溶液吹悬混匀，在温度为4℃的条件下离心70min，缓慢倒掉上清液，室温晾干3～5min，沉淀即为外泌体，其中，所述外泌体的表面含有大于500μg/ml的ACE2蛋白。

2.根据权利要求1所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述pVSV：pGAG：pREV：已构建好含有人源ACE2基因的pLV-puro质粒的质量比为2.8:5.3:4.1:7.9。

3.根据权利要求1所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述离心的温度均为4℃。

4.根据权利要求1所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述无菌PBS溶液经过0.22μm孔径滤膜过滤。

5.根据权利要求1所述的一种表达ACE2蛋白的外泌体的制备方法，其特征在于：所述外泌体重悬于1×PBS缓冲液，并保存在温度为-80℃的条件下。