[发明专利]一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法

说明书

本发明公开了一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex‑YG‑TrMU202001基因工程菌。本发明构建的dex‑YG‑TrMU202001基因工程菌合成的糖苷产物单一，且转化率高，分离纯化简单，同条件下，经产率计算发现，本发明构建的dex‑YG‑TrMU202001基因工程菌能将大部分咖啡酸苯乙酯转化为2G‑咖啡酸苯乙酯，二糖苷产率由原来的24％提高到了84％，且反应液中无原料剩余，二糖苷产物提高了3.46倍。

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，具体涉及一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法。

背景技术

多酚类天然化合物种类繁多，化学结构多样、新颖，广泛存在于自然界中，具有抗肿瘤、抗氧化，消炎、抗菌、保护心脑血管等多种重要的生理及药理功能，因此受到广泛关注，但未加修饰的天然产物水溶性差、生物利用度低，限制了其的应用，经研究发现糖基化是改善天然产物水溶性和稳定性，进而调节其生物活性的有效途径。酶促反应具有立体选择性和区域选择性高以及合成步骤数量少，催化效率高，反应条件温和等特点，因此环境更友好，合成更安全，已被证明可以克服大多数化学修饰的缺点，酶促糖基化改善天然产物理化性质，扩大天然产物的应用逐渐成为国内外研究的热点。

右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase(EC2.4.1.5)是由白串珠菌属、链球菌属以及乳酸菌属的乳酸菌产生的胞外酶，属于70家族糖苷水解酶(GH70)，可以利用蔗糖为糖基供体，基于不同类型的受体，发生三种不同的反应：1)葡聚糖延伸反应，初期主要通过水解蔗糖，形成葡萄糖单元，以及以蔗糖为受体的寡聚糖，中后期主要以延伸大分子葡聚糖链为主，在果糖浓度高时也会形成明串珠菌二糖；2)以水为受体，将蔗糖水解为果糖和葡萄糖的水解反应；3)以多羟基化合物为受体，对多羟基化合物进行糖基化修饰的受体反应。根据目前已解析出来的GH70三维结构，认为从N端到C端，多肽链构成域依次为V、IV、B、A、C、A、B、IV和V，呈u型排列，催化核心由A、B、C三个结构域构成，与核心结构域相连的是两个额外的区域，即IV和V。在催化区域，-1位点氨基酸对维持催化过程过渡态稳定性至关重要，+1、+2是受体结合部位。

目前右旋糖酐蔗糖酶的受体反应已用于改善多种多羟基化合物的理化性质，其中包括槲皮素、对苯二酚、咖啡酸苯乙酯等，在水溶性及细胞毒性方面都有极大的改善，但由于该酶的三种催化反应同时存在，使得反应产物包含多种糖苷产物，且单一产物含量低。例如李瑶等人利用P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶dextransucrase(EC2.4.1.5)糖基化了咖啡酸苯乙酯，主要得到两种糖基化产物混合物:咖啡酸苯乙酯二糖苷产物(咖啡酸苯乙酯-2G)和单糖苷产物(咖啡酸苯乙酯-G)，但是产量都很低，需严格把控反应时间否则会转化成多糖基化合物，造成了分离纯化过程的繁琐，为获得单一产物，降低成本，适合工业生产，扩大实际应用价值，利用蛋白质工程对受体结合部位氨基酸残基进行理性设计，提高右旋糖酐蔗糖酶转塘基产物的特异性的已成为国际研究热点和解决问题的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其可以解决上述背景技术提出的技术问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺后重组转化到BL21(DE3)大肠杆菌中获得的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21(DE3)/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。