[发明专利]一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法

权利要求书

1.一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺后重组转化到 BL21（DE3）大肠杆菌中获得的适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌 BL21（DE3）/dex-YG-TrMU202001基因工程菌，野生型右旋糖酐蔗糖酶的基因序列号为Genbank No. DQ345760。

2.根据权利要求1所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤：以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接，引物设计、重组质粒构建和宿主菌转化。

3.根据权利要求2所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述以咖啡酸苯乙酯为受体底物，进行分子对接的具体步骤如下，将咖啡酸苯乙酯与P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶蛋白活性位点通过EasyModeller、Discovery Studio、PyMOL软件模拟对接，找到相关氨基酸，将555位点天冬酰胺突变为谷氨酰胺，进行可行性分析。

4.根据权利要求3所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述引物设计是根据P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因序列和载体 pET-28a-(+)的序列，借助SnapGene软件设计突变引物如下：

上游引物：

5’ -----GTGTAGATGCAGTCGACCAGGTGGATGCTG -----3’

下游引物：

5’ -----CTGGTCGACTGCATCTACACGAATACCATC -----3’。

5.根据权利要求4所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述重组质粒构建是以P473S/P856S双突变的热稳定型右旋糖酐蔗糖酶基因为模板，利用所设计引物，通过 PCR 扩增技术，经DMT消化原始模板，得到重组表达质粒 pET-28a-(+)-dex-YG-TrMU202001。

6.根据权利要求5所述的一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌的构建方法，其特征在于：所述宿主菌转化是将重组表达质粒pET-28a+dex-YG-TrMU202001转化到大肠杆菌感受态细胞 BL21（DE3）中，经过卡那霉素抗性筛选、酶切、菌液 PCR 和 DNA测序验证后，获得适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌 BL21（DE3）/dex-YG-TrMU202001基因工程菌。

7.一种适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌，其特征在于：权利要求1中所述的 BL21（DE3）/dex-YG-TrMU202001 基因工程菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为适合二糖苷转移功能的重组右旋糖酐蔗糖酶大肠杆菌BL21（DE3）（Escherichia coli），保藏日期为2020年08月10日，保藏编号为CGMCCNo.20509。