[发明专利]一种通过灌流培养工艺制备腺病毒载体疫苗的方法

说明书

本发明公开了一种通过灌流培养工艺制备腺病毒载体疫苗的方法。其中，该方法包括腺病毒宿主细胞的培养步骤，特别是根据细胞密度调节灌流速率（例如至少通过两个阶段调节灌流速率）的步骤。该方法在实现腺病毒宿主细胞高密度生长的同时，提高了感染后的病毒的单细胞产量，以及病毒收获液的比活。

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种腺病毒宿主细胞的培养方法、腺病毒的生产方法以及腺病毒载体疫苗的制备方法，特别是通过灌流培养工艺制备腺病毒载体疫苗的方法。

背景技术

腺病毒是一种无包膜DNA病毒，具有易感染、宿主范围广、毒性低、使用安全、容纳量大、非整合性、对人致病性小且不诱导癌变等特点，使得腺病毒载体成为基因转移中最有前途的基因载体之一。

改造后的腺病毒去除了E1/E3基因表达盒，阻止了依赖E1区和E3区功能蛋白的转录与随后病毒DNA的复制及病毒外壳蛋白的产生，E1/E3缺失的腺病毒在能够提供E1/E3区基因蛋白的细胞中得到增值。

腺病毒具有宿主范围广、高转基因表达能力的特点，目前有高达300种人用治疗或者预防性重组腺病毒药物正用于临床试验，广泛应用的腺病毒载体是人血清型腺病毒Ad5、Ad26型和黑猩猩3、68型腺病毒；以腺病毒作为载体的疫苗也有多个处于临床研究中。

重组腺病毒载体疫苗是以腺病毒作为载体，将保护性抗原基因重组到腺病毒基因组中，腺病毒感染细胞后，可以将腺病毒基因组连同保护性抗原基因一起注入宿主细胞，从而在细胞内表达保护性抗原，产生体液和细胞免疫。目前有多个腺病毒载体疫苗处于临床前或者临床中，如人体免疫缺陷病毒（HIV）、狂犬病毒（RV）、乙肝病毒（HBV）、病肝病毒（HCV）、登革热病毒（DEN）、疱疹病毒（EB）埃博拉病以及新型冠状病毒。

293细胞是最常用的腺病毒载体包装和生产用宿主细胞。293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等；293细胞一般为贴壁生长，但是也有适应悬浮培养的细胞系。HEK293细胞含有腺病毒的E1/E3区，因此，可以用于复制缺陷型腺病毒载体的生产。

现有技术中，293细胞生产腺病毒受限于细胞密度低和细胞产毒少导致产量少，细胞密度低的主要原因是细胞培养受营养供给、氧气、代谢影响很难对293细胞进行高密度培养。受感染细胞与正常细胞生长、营养物质的竞争，以及受染细胞的状态等导致产毒不高。虽然定期补加新鲜培养基，用于维持营养环境，可以提高细胞的生长，但是这种生长有限。

发明内容

为克服现有技术的不足，本发明提供一种腺病毒宿主细胞的培养方法，其包括灌流培养的步骤，特别是根据细胞密度调节灌流速率（例如至少通过两个阶段调节灌流速率）的步骤。

具体地，上述方法包括如下步骤：

（1）接种宿主细胞，进行细胞培养；

（2）细胞密度达到1~5×10⁶个/mL（具体如1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶个/mL）后开启灌流，灌流速率为1-3VVD（容器体积/天）（例如1、1.5、2、2.5、3VVD）；

（3）细胞密度生长至5~10×10⁶个/mL（具体如5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、9×10⁶、10×10⁶个/mL）后，调节灌流速率至2-4VVD（例如2、2.5、3、3.5、4VVD）。

具体地，上述细胞培养在生物反应器（例如一次性搅拌式反应器或激流式反应器）中进行。