[发明专利]一种快速鉴定shRNA有效性的方法

说明书

本发明公开了一种快速鉴定shRNA有效性的方法，包括以下步骤：(1)设计并合成多条候选shRNA作为候选功能性shRNA；(2)构建基于慢病毒载体的PLKO.1‑shRNA重组载体；(3)在HEK293/HEK293T细胞中，利用细胞瞬时转染方法，共转染入细胞；(4)转染完成6‑8小时后，给细胞更换新鲜培养基并继续培养24‑48小时；(5)收取细胞并裂解细胞，提取总蛋白；(6)Western Blot检测目的蛋白表达并通过比较对照组与处理组中目的蛋白表达差异鉴定候选shRNA的有效性。本发明节省时间成本约50％，整体实验工作量降低约70％，人工成本也显著大幅度降低。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种快速鉴定shRNA有效性的方法。

背景技术

基于RNA干扰技术实现目标基因沉默是现代生命科学及遗传工程操作的重要应用基础之一。在细胞水平实现基于RNA干扰的目标基因沉默有两种主要方法。一、基于siRNA瞬时转染介导的目标基因沉默；二、基于shRNA慢病毒包装感染细胞介导的目标基因沉默；其中，第二种方法由于能够实现稳定的目标基因沉默，并且对于不同的细胞类型均能实现有效应用因而具有更广泛的应用范围。

shRNA的序列设计必然是基于目标基因自身的序列顺序而设计，针对同一目标蛋白，可以设计多条shRNA序列。但是，大量的实证研究都表明，这些候选shRNA并非都具备有效的靶向沉默目标基因表达的功能。其有效性需在实际的研究进程中，将其导入目标细胞内之后，通过对目标蛋白表达丰度的检测，根据目标蛋白表达量的降低程度予以鉴定。真正有效的shRNA序列方能用于后续的研究及相关具体应用。因而，对于候选shRNA的有效性筛选鉴定是一个在细胞及遗传工程前期一个必须且至关重要的关键工作流程，直接决定了后续应用的成败。

传统的检测shRNA有效性方法需经过慢病毒包装及细胞感染过程，生物安全性风险相对较高，需要在生物安全II类实验室进行；所需要的生物安全准入门槛相对较高。

此外，传统的检测shRNA有效性方法需经过慢病毒包装，感染，阳性克隆筛选等流程，整个流程需要约8-10天的时间方可获取候选shRNA有效性的准确数据；时间成本，工作量负荷及人工成本均相对较高。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速鉴定shRNA有效性的方法，解决现有的鉴定方法生物安全性风险高、时间长、成本高的问题。

本发明的技术方案为：一种快速鉴定shRNA有效性的方法，包括以下步骤：

(1)根据目标基因序列设计并合成多条shRNA序列作为候选功能性shRNA；

(2)通过引物退火的方法构建基于慢病毒载体PLKO.1的shRNA重组载体质粒；

将携带表达标签与目标基因的融合过表达重组载体

(3)在HEK293/HEK293T细胞中，利用细胞瞬时转染((脂质体转染，磷酸钙转染等)方法，将携带表达标签(FLAG,HA,MYC,V5等)的目的基因过表达重组载体质粒与候选shRNA重组载体质粒按照1︰8～1：15的质量比例共转染入细胞；

(4)转染完成6～10小时后，更换新鲜细胞培养基，并继续培养24～48小时；

(5)按照标准流程收取细胞，并裂解细胞，提取总蛋白；

(6)Western Blot检测，利用beta-actin抗体杂交结果作为内参调平上样量后，采用标签抗体检测目标蛋白在对照组和处理组中的表达丰度，根据目标蛋白表达量的降低程度鉴定候选shRNA的有效性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：