[发明专利]一种快速鉴定shRNA有效性的方法在审
| 申请号： | 202011227504.9 | 申请日： | 2020-11-06 |
| 公开（公告）号： | CN112301061A | 公开（公告）日： | 2021-02-02 |
| 发明（设计）人： | 张昊星;李延鹏;李嘉恒;吴精博;应明 | 申请（专利权）人： | 深圳大学 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N15/65;C12Q1/68;G01N33/68 |
| 代理公司： | 成都方圆聿联专利代理事务所(普通合伙) 51241 | 代理人： | 李鹏 |
| 地址： | 518055 广东省深圳市南山区*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 快速 鉴定 shrna 有效性 方法 | ||
【权利要求书】：
1.一种快速鉴定shRNA有效性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据目标基因序列设计并合成多条shRNA序列作为候选功能性shRNA；
(2)通过引物退火的方法构建基于慢病毒载体PLKO.1的shRNA重组载体质粒；
将携带表达标签与目标基因的融合过表达重组载体
(3)在HEK293/HEK293T细胞中，利用细胞瞬时转染方法，将携带表达标签的目的基因过表达重组载体质粒与候选shRNA重组载体质粒按照1︰8～1：15的质量比例共转染入细胞；
(4)转染完成6～10小时后，更换新鲜细胞培养基，并继续培养24～48小时；
(5)按照标准流程收取细胞，并裂解细胞，提取总蛋白；
(6)Western Blot检测，利用beta-actin抗体杂交结果作为内参调平上样量后，采用标签抗体检测目标蛋白在对照组和处理组中的表达丰度，根据目标蛋白表达量的降低程度鉴定候选shRNA的有效性。
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