[发明专利]荧光原位杂交探针及其制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种荧光原位杂交探针及其制备方法与应用，制备方法包括步骤：设计多条与目标核酸序列结合的杂交序列；通过质粒构建得到串联重复的标记序列；将杂交序列和标记序列的重复片段串联，之后将得到的产物回收并利用外切酶消化，将得到的单链DNA探针标记，得到荧光原位杂交探针。本发明通过修饰引物PCR将杂交序列与标记序列串联，利用相应的序列特异性核酸结合蛋白融合荧光蛋白等将信号引导并结合到标记序列，降低了传统寡链引物化学修饰较高的费用，串联重复的序列和多探针的探针组设置显著提高了信号强度；通过外切酶将所得双链PCR产物进行有限消化获得单链末端，比双链探针达到更好的杂交效果；操作简单，成本低。

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体涉及一种荧光原位杂交探针及其制备方法与应用。

背景技术

原位杂交是通过特定标记的已知核酸序列为探针与细胞或组织切片核酸序列进行精确定位的过程。因此可以借助于原位杂交得到细胞中特定RNA或DNA的位置信息，对分子水平的机制做出判断。

目前荧光原位杂交的探针中的寡链核苷酸的制备和标记较为复杂，合成寡链核苷酸引物需要通过化学修饰将荧光基团或生物素等连接到引物上，制备成本较高。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种荧光原位杂交探针及其制备方法与应用，以解决原位杂交探针中寡链核苷酸制备操作复杂、化学修饰成本较高不适合大量制备等问题。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

第一方面，本发明提供了一种荧光原位杂交探针的制备方法，包括步骤：设计多条与目标核酸序列结合的杂交序列；通过质粒构建得到串联重复的标记序列；将杂交序列和标记序列的重复片段串联，之后将得到的产物回收并利用外切酶消化，得到单链DNA探针；将单链DNA探针进行标记，得到荧光原位杂交探针。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，多条为3-20条；杂交序列的长度为30-40bp。长度30-40bp可以适当增加杂交的特异性，多条探针组成的探针组可以增加信号强度。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，标记序列为能与序列特异性核酸结合蛋白如LacI结合的DNA序列如乳糖操纵子LacO。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，通过质粒构建得到串联重复的标记序列具体包括：在质粒上构建得到串联重复的标记序列，如如乳糖操纵子LacO的变体Osys，两个相邻的标记序列间隔为10-20bp，优选为15bp；串联重复序列以2段序列(2X序列)为基础，以一对同尾酶分别位于2段序列(2X序列)两端，另一限制性内切酶位于外围，通过同尾酶粘性末端连接，以此重复酶切连接，得到8-32段重复(8-32X)的标记序列。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，将杂交序列和标记序列的重复片段串联具体包括：通过修饰引物PCR用5’端携带杂交序列的修饰引物和另一反向引物以标记序列的突变体为模板，将杂交序列和标记序列的重复片段串联，所得片段在标记序列两端延长20bp以上。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，将得到的产物回收并利用外切酶消化具体为将得到的PCR产物回收并利用T5外切酶有限消化；单链DNA探针为末端具有30-40nt单链DNA片段。

优选地，荧光原位杂交探针的制备方法中，将单链DNA探针进行荧光标记具体包括：将单链DNA探针与样品杂交后洗涤，洗涤是依次采用wash buffer1和wash buffer2进行洗涤，再加入融合蛋白于37℃孵育30min，之后加入DAPI染色孵育5min即可；其中，融合蛋白是将结合蛋白与第一蛋白融合表达并纯化制备而得，如LacI-eGFP；第一蛋白为荧光蛋白和/或报告酶。

第二方面，本发明还保护根据上述方法制备得到的荧光原位杂交探针。