[发明专利]一种活性提高的EstWY酶突变体

说明书

本发明公开一种活性提高的EstWY酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明利用无系统发育偏见的共识方法对EstWY酶序列进行分析得到筛选得到活性显著提升的单点突变体并对其进行定点突变，获得对活性提高的突变Y179E/V190D、T196R/L202H、V190D/A193H/T196R酶与野生型相比，这些突变酶的活力提升3倍。本发明所提供的EstWY酶突变体的活性更好，在较高的温度下催化肌酸生成脂酸和醇类时表现出优良的催化活性，同时构建的EstWY酶基因工程菌可以高效表达EstWY酶突变体，且培养条件简单，培养周期短，表达产物纯化方便等优点。

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种活性提高的EstWY酶突变体。

背景技术

酯酶（Esterase）是催化酯类化合物水解的酶系，其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯。在水分子的参与下，经过水解作用，将酯类水解为酸类及醇类。反应式如下：R-COOR^/（酯）+H₂O（水）====RCOOH（脂酸）+R^/OH（醇）。它广泛存在于动物、植物和微生物中。其中，动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，使得酯酶广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性/对映选择性，它是合成手性化合物的高效生物催化剂。然而，由于天然酶本身活力较低，在环境苛刻的工业应用过程中发挥应用，因此天然酶在应用中往往遇到活性较低等问题。为此必须选择活性较高的酶来满足工业生产的要求。通过蛋白质工程手段，提升Escherichia coli 酯酶（EstWY酶）的活性，是解决这一问题的关键。

发明内容

为了更好的将Escherichia coli 酯酶（简称：EstWY酶）应用于工业处理，提高其生理学活性，本发明采用定点突变，获得了活性显著提升的突变酶，解决了现有的EstWY酶活力较差的缺陷不能满足应用于试剂的需求，为拓宽EstWY酶的工业应用奠定了基础。

本发明第一个目的是提供一种Escherichia coli 酯酶（EstWY酶）的突变体，所述EstWY酶突变体为如下（a1）或（a2）所示：

（a1）将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.1的蛋白具有相同功能的衍生蛋白；

（a2）通过一个或多个氨基酸残基取代SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的一个或多个位置且与SEQ ID NO.1示的蛋白表现出至少95%同源性的衍生蛋白。

进一步地，EstWY酶突变体如SEQ ID NO.1示的氨基酸序列的突变位点包括以下至少一个：第179位、第190位、第193位、第197位及第202位。

进一步， EstWY酶突变体包括在SEQ ID NO.1示的氨基酸序列上Y179E、V190D、A193H、T197R、L202H中任一单点突变位点的单点突变体。

进一步，EstWY酶突变体包括在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列上V190D/A193H、A193H/T197R、Y179E/V190D、T197R/L202H、Y179E/V190D/L202H、V190D/A193H/T197R。

本发明的第二个目的是提供编码EstWY酶突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因含有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

本发明的第三个目的是提供含有所述基因的载体。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。