[发明专利]一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种热稳定性提升的Escherichia coli酯酶(EstWY酶)突变体，属于酶工程技术领域。本发明通过对源自Escherichia coli菌株的EstWY酶基因进行突变及密码子优化，获得热稳定性显著提高的突变酶。与野生型半衰期相比，突变体在45℃半衰期大约是野生型的5倍，这表明突变体相比于野生型，同时构建的高效表达的基因工程菌，具有其培养周期短、培养条件简单、目的蛋白产量高、纯化简单的优点。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种热稳定性提高的酯酶突变体及其应用。

背景技术

酯酶(Esterase)是催化酯类化合物水解的酶系，其作用是水解脂肪族酯和芳香族酯。在水分子的参与下，经过水解作用，将酯类水解为酸类及醇类。反应式如下：R-COOR/(酯)+H₂O(水)＝＝＝＝RCOOH(脂酸)+R/OH(醇)。它广泛存在于动物、植物和微生物中。其中，动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，使得酯酶广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性/对映选择性，它是合成手性化合物的高效生物催化剂。然而，由于天然酶都是在体内比较温和的环境中发挥作用的，而工业应用过程要求酶在比较严苛的环境(如高温、极端酸碱度、有机溶剂、非天然底物、产物抑制等)中发挥作用，因此天然酶在应用中往往遇到稳定性差等问题。为此必须选择稳定性良好的酶来满足工业生产的要求。通过蛋白质工程手段，提升EstWY酶的热稳定性，是解决这一问题的关键。

常用的蛋白质工程方法有理性设计(rational design)和非理性设计(irrational design)，分别基于结构功能--关系和高通量筛选。理性设计存在准确性的缺陷，主要在于蛋白质结构--功能关系过于庞杂，现今仍缺乏充足的认识。为了有效优化蛋白质的热稳定性，Markus Wyss等人于2001年提出共识理论(Consensus Concept)。和理性设计基于蛋白质精确结构-功能关系不同的是，Consensus Concept理论是基于同源蛋白的氨基酸序列信息，从进化的角度分析能提高酶热稳定性的信息。

使用原始菌种(如Fervidobacterium nodosum)发酵，存在培养条件苛刻、产酶水平低的问题，获得目标酶较为困难。同时，原始菌种酶系复杂，不能直接使用，而且纯化步骤繁琐，纯化得到的酶也不能直接使用，存在稳定性差的问题。

自然进化限制了原始EstWY酶的功能，往往不能以最佳的状态应用在工业途径中。使用蛋白质工程的方法，可以对原始基因进行分子改造，打破自然进化的限制，获得适合工业用途，性质优良的新酶基因。所以现阶段EstWY酶的高效表达、纯化及应用端的需求问题一直是本领域技术人员研究的重点和难点。

发明内容

本发明以共识理论(Consensus Concept)为指导思想，对酯酶家族序列进行整合分析，并结合生物信息学及晶体学方法辅助，获得具高稳定性的新型酯酶突变体。

为了解决上述技术问题，本发明利用共识设计方法获得了热稳定性提高的的EstWY酶突变体、本发明采用基于传统的共识方法改进的无系统发育偏见的共识方法筛选得到5个氨基酸突变位点并对其进行定点突变，获得了热稳定显著提升的突变酶，解决了现有的EstWY酶热稳定性差，不能满足应用于试剂的需求的缺陷，为拓宽EstWY酶酶的工业应用奠定了基础。

本发明第一个目的是提供一种EstWY酶，EstWY酶是来源于Escherichia coli的EstWY酶，命名为ENND-TOP蛋白，编码ENND-TOP蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，EstWY酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，EstWY酶是SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且与SEQ ID NO.2所示的蛋白具有相同功能的衍生蛋白。