[发明专利]一种组织工程心肌补片制备方法

权利要求书

1.一种组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、取成年猪心，分离左心室；

S2、冲孔机打孔获取左心室心肌块；

S3、心肌块冻存于-80℃至少16小时；

S4、解冻心肌块，切取厚度为1cm心肌块并用琼脂糖包埋；

S5、用陶瓷叶片振荡切片机，在1mm振幅、速度0.01～0.03mm/秒、100Hz振动频率条件下，切割心肌块，获得厚度约为300-500μm、直径约为14mm的心肌组织薄片；

S6、使用SDS和Trixon X-100液体，洗涤和浸泡心肌组织薄片，制备得到去细胞心肌组织薄片；

S7、将hiPSC-CM体外定向诱导分化14-16日；

S8、胰蛋白酶消化获取细胞悬液，以2×107个细胞/cm2接种量，种植iPSC-CMs于S6制备的去细胞心肌组织薄片，继续培养载hiPSC-CM组织工程心肌薄片1-28日得到组织工程心肌补片。

2.根据权利要求1所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，对S5得到的心肌组织薄片浸于PBS中，保温4℃过夜。

3.根据权利要求2所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述步骤S6中，制备去细胞心肌组织薄片的步骤为：

S61、对浸于PBS中，保温4℃过夜的心肌组织薄片用1％SDS洗涤两次，每次1.5小时；

S62、无菌蒸馏水洗涤15分钟；

S63、1％Trixon X-100洗涤7分钟；

S64、PBS洗涤3次，每次15分钟；

S65、将心肌组织薄片浸于PBS，置于110rpm摇床室温过夜；

S66、心肌组织薄片在14mm无菌塑料玻片上铺开，薄片外缘固定于玻片边缘得到去细胞心肌组织薄片。

4.根据权利要求3所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述步骤S61、S62、S63和S64均在室温150rpm摇床上进行。

5.根据权利要求1所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述步骤S7中，将hiPSC-CM诱导分化具体步骤为：

S71、将iPSC以100,000细胞量种植于geltrex包被6孔板；

S72、每日给予2ml Essential 8^TM培养基；

S73、第4日细胞铺满板底75-85％传代；细胞传至第4代备用；

S74、以80,000细胞量种植步骤S73备用的细胞于geltrex包被6孔板单层细胞培养，每日给予2ml Essential 8^TM培养基,于第4日更换培养基为B27-insulin，并添加6μmolCHIR99021；

S75、激活Wnt途径，诱导分化第3日添加5μmol IWR-1，抑制Wnt途径，第5日更换为2mlB27-insulin培养基，以后隔日换液，诱导分化第8-10日观察到跳动的诱导成功的心肌细胞。

6.根据权利要求5所述的组织工程心肌补片制备方法，其特征在于，所述诱导成功的心肌细胞纯度鉴定包括：流式细胞术检测hiPSC-CM纯度；

具体包括如下步骤：

步骤一、心肌细胞经过消化后，4％PFA固定；

步骤二、0.3％Triton打孔，5％BSA封闭；

步骤三、一抗孵育，PBS漂洗2次；

步骤四、二抗孵育，PBS漂洗2次；

步骤五、流式细胞仪检测hiPSC-CM中α-actinin+、cTNT+、MLC2V+及MLC2a+细胞所占比例。